多聚酶链式反应扩增DNA片段(上课)

参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物细胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸一、PCR（多聚酶链式反应）1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2．原理1)DNA的热变性：在80～100℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。多聚酶链式反应DNA双螺旋变性引物3、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。（1）变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。（2）复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。（3）延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性90

℃50

℃碱基互补配对72

℃DNA聚合酶1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸高温变性低温复性重复1～3步30轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸变性→复性（退火）

→

延伸PCR的反应过程5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。三、PCR实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器

用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够自动调控温度的仪器PCR扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。4、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次９4℃，1min55℃，30s72℃，1min（二）操作步骤：实验注意事项1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。四、结果分析与评价DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算50倍蒸馏水做对照波长260nm处读数（一）理论上DNA扩增数目的计算1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、

a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理

可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关光吸收波长／nm2602402202800.10.22、过程①稀释2µL

PCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值③测定并计算DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制PCR技术解旋在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向子链的5’端向3’端延伸子链的5’端向3’端延伸课堂小结多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR仪设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算练习巩固：1.做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是

A.反复洗涤B.不