丙型肝炎实验室诊断技术研究进展

丙型肝炎实验室诊断技术

研究进展丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。全球HCV的感染率约为3％，每年新发HCV病例约315万例，我国人群抗-HCV阳性率为3.2％，近4千万感染者。以长江为界，北方(3.6％)高于南方(2.9％)。目前尚无有效疫苗用以预防丙型肝炎。母婴传播率不超过6％。HCV是单链RNA病毒，包含约9600个碱基。HCV包含至少6种主要的基因型和大量的基因亚型。每种基因型的氨基酸顺序差异约为30％。按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b等)。基因型的分布存在地区差异。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。在我国大陆地区，以1b、2a型为主，输血途径感染者多为1b型，在欧洲和日本以1b型为主，中东地区以4型常见，6型主要见于香港和澳门地区。基因型的意义在于其与抗病毒治疗效果的相关性十分密切。1.抗HCV抗体检测1.1ELISA目前临床诊断和采供血机构多采用第三代ELISA试剂，其在第二代试剂的基础上增加了非结构区NS3区C33C抗原的比例，且采用基因重组技术、抗原纯度和活性提高，灵敏性、特异性均有较大提高。1.2胶体金法(PA)

原理：将胶体金结合HCV重组抗原固相于玻璃纤维上，待测样本中抗-HCV与之反应形成复合物，后者向上移动被固定于硝酸纤维素膜上的HCV抗原捕获，形成一条阳性色带，15min即可判断结果。优点：该方法操作简单、无需特殊实验条件及仪器设备，灵敏度及特异性均较高，对丙型肝炎的早期发现及预防控制有重要参考价值。1.3化学发光技术(CLIA)是化学发光测定技术与特异性免疫反应相结合的一种检测方法，可行抗-HCV定性、定量检测，灵敏度、准确性较高，且可避免放射污染，临床应用趋于广泛。1.4重组免疫印迹实验(RIBA)利用基因重组技术和包被技术将HCV不同重组抗原片段包被于醋酸纤维薄膜条带的不同位置，待测样本中抗-HCV与之结合后产生色带。第一代RIBA试剂含有C100-3、5-1.1两种抗原(包括SOD序列)，与ELISA相比特异性明显提高，但灵敏度降低；第二代RIBA试剂在第一代基础上增加了3个重组多肽，灵敏度和特异性均有较大提高，是抗-HCV确证的金标准；第三代mBA在第二代基础上增加了NS5区抗原，可用于对第二代RIBA结果不确定标本的确证。2HCV核酸检测

2.1HCV-RNA定性、定量检测①PCR：是一种模拟体内天然DNA复制过程的体外核酸扩增技术。RT-PCR是将RNA反转录和cDNA聚合酶链式扩增相结合的技术。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。检测低限为50～100IU/ml。临床PCR单项阳性结果即可确诊HCV感染。②支链DNA(bDNA)技术：是一种不依赖PCR的核酸放大定量方法。bDNA分支可结合RNA与包被于固相板上的探针杂交，固定后加入多个靶探针分别与HCVRNA5’非编码区和核心抗原区的不同位点杂交使信号放大数十倍，加入bDNA扩增后可与各靶探针结合，使每个核酸信号得以放大数百倍，通过底物发光检测。bDNA技术的优点是放大倍数确定、重复性好，可用于HCVRNA的动态变化研究，但其检测限高于RT-PCR方法。③转录介导的扩增术(TMA)：特点是利用MMLV逆转录酶和T7RNA聚合酶2种酶的共同作用。优点为整个反应在一个试管中进行，显著减少了污染的可能。与RT-PCR比较定性检测低限更低。2．2HCVRNA基因型检测HCV可分为6种主要基因型及11个主要亚型。①限制性片段长度多态性方法(RFLP)：是较早出现的分型方法，其利用RT-PCR扩增具有不同酶切位点的各种HCV基因型，PCR产物被3～5种不同的限制性内切酶消化后，将电泳结果与已知限制性片段数据库比较确定其基因型。PCR-RFLP扩增的区域可以是5’UTR、核心区及NSSB。但RFLP由于其检测准确性低、成本高等原因，临床应用较少。②反相线性探针杂交法(Li-PA)：基于反相杂交原理，通过生物素标记的引物扩增HCV5’UTR，产物变性后与硝酸纤维膜上基因型特异探针杂交，加入碱性磷酸酯酶和显色底物BT/BCIP后可显现紫色或棕色条带。该技术检测成本低，与金标准一致性很高，应用前景较好。③测序法：原理是扩增HCV基因组种系信息区(NS5B、核心区或E1)并测序，将结果与已知基因型序列比较从而判断基因型，是HCV基因型检测的金标准。该法成本较高，临床应用较少，但在流行病学研究和亚型检测中能提供更全面的信息。④基因芯片技术：基本原理是将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样本分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度获取样本分子的数量和序列信息。该技术应用广泛，可一次性对样品大量序列进行检测和分析，操作简单、自动化程度高。3HCV抗原检测

HCV核心抗原(HCV-cAg)与HCVRNA的动力学变化密切相关，可作为HCV复制的标志。HCV-cAg氨基酸序列保守，是目前HCV抗原检测的主要目的抗原片段。血清中HCV抗原含量很低，用常规ELISA等方法很难检出。近几年来，灵敏、可定量且适合自动化检测的HCV抗原检测试剂已经研发成功，有望进入临床实验室。另外，HCV-cAg存留时间短(27～70d)，结果判定还应结合抗-HCV检测情况。4其他检测技术

4.1蛋白芯片技术原理：先获取HCV融合抗原及分片段抗原，点样于醛基化玻片等载体上，制成HCV不同片段抗体蛋白芯片，待测样本加入芯片后发生免疫反应，利用荧光或酶显色进行检测。优点：该法不仅能检测血清中有无HCV抗体，还能同时检测血清或血浆中抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNs5及抗HCV总抗体5项指标，具有自动快捷、灵敏特异、高通量等特点。4.2环介导等温基因扩增技术(LAMP)