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人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围:96T6ng/L-180ng/L使用目的:本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中 1,25二羟基维生素 D3(1,25-(OH)2D3)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)水平。用纯化的人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3),再与HRP标记的1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值),通过标准曲线计算样品中人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3)浓度。试剂盒组成130倍浓缩洗涤液20mlx1瓶7终止液6mlx1瓶2酶标试剂6mlx1瓶8标准品(320ng/L)0.5mlx1瓶3酶标包被板12孔x8条9标准品稀释液1.5mlx1瓶4样品稀释液6mlx1瓶10说明书1份5显色剂A液6mlx1瓶11封板膜2张6显色剂B液6mlx1/瓶12密封袋1个标本要求1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-209保存,但应避免反复冻融不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。操作步骤标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。160ng/L5号标准品150卩1的原倍标准品加入150卩1标准品稀释液80ng/L4号标准品150卩l的5号标准品加入150卩l标准品稀释液40ng/L3号标准品150卩l的4号标准品加入150卩l标准品稀释液20ng/L2号标准品150卩l的3号标准品加入150卩l标准品稀释液10ng/L1号标准品150卩l的2号标准品加入150卩l标准品稀释液加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50卩1,待测样品孔中先加样品稀释液40卩1,然后再加待测样品10M(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。温育:用封板膜封板后置379温育30分钟。配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。加酶:每孔加入酶标试剂50卩1,空白孔除外。温育:操作同3。洗涤:操作同5。显色:每孔先加入显色剂A50M,再加入显色剂B50M,轻轻震荡混匀,379避光显色15分钟.终止:每孔加终止液50^1,终止反应(此时蓝色立转黄色)。测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。操作程序总结:洗板5次,加入显色液A、B>37C显色洗板5次,加入显色液A、B>37C显色10分钟加入准备好的样品和标准品,37C反应30分钟洗板5次,加入酶标试剂,37C反应30分钟准备试剂,样品和标准品15分钟之内读0D值加入终止液计算计算以标准物的浓度为横坐标,0D值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的0D值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与0D值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的0D值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。注意事项1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。4•请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本0D值大于标准品孔第一孔的0D值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(xnx5)o5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。6.底物请避光保存。7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读
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