从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案

从土壤中分别产淀粉酶的芽孢杆菌试验方案TheStandardizationOfficewasrevisedontheafternoonofDecember13,2023土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性试验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布格外广泛，是人们常常争论的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、分散芽孢【3】。由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，很多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体外表及水体中【4】。所以此次实验从土壤中分别产淀粉酶的芽孢杆菌。二、试验目的要求二、试验目的要求了解生物分别提纯的原理和方法技术把握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法把握微生物摇瓶培育方法及淀粉酶活力测定的原理和方法培育学生的综合应用微生物试验方法的力量培育学生自行设计试验流程、综合分析问题解决问题和推断试验结果的力量。三、试验原理和生命活动中所需的各种条件。般地说，在土壤外表，由于日光照耀及枯燥等因素的影响，微生物不易生存，【5】。分别与纯化。平板分别法普遍用于微生物的分别与纯化。其根本原理是选择适合与待分别微生物的生长条件，如养分成分、酸碱度、温度和氧等要求，或参加某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，从微生物群体中经分别生长在平板上的单个菌落并不肯定保证是纯培育。因此，纯培育确实定除观看其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培育要经过一系列分别与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。值得指出的是，从微生物群体中经分别生长在平板上的单个菌落并不肯定保证是纯培育。因此，纯培育确实定除观看其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培育要经过一系列分别与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；养分体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—822%NaCl25%NaCl；养清楚胶〔22℃〕71厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为养分生长的最低限培育基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源【6】。细菌特性生殖快速:106倍。:无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧生殖)、耐低氧(厌氧生殖)。体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长生殖。四、试验材料和用具土样采集土样采集：采集宽阔植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤养分琼脂(%)1牛肉膏氯化钠琼脂～蒸馏水15%2mL，校正pH至～。参加琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。淀粉牛肉膏蛋白胨培育基(%)：可溶性淀粉牛肉蛋白氯化钠琼脂～pH至～发酵培育基(%)：玉米粉2 黄豆饼粉CaCl MgSO4 NaClK2HPO4柠檬酸钠硫酸氨(溶解后加) 校正pH值葡萄糖蛋白胨培育基〔试验用〕〔%〕：葡萄糖蛋白胨K2HPO4 校正pH～蛋白胨水培育基〔吲哚试验用〕〔%〕：1%氯化钠%校正pH～西蒙氏柠檬酸盐培育基〔%〕：氯化钠硫酸镁(MgSO4·7H2O) 氢铵磷酸氢二钾柠檬酸琼脂2溴麝香草酚蓝溶液4酚红试剂校正pH，再参加琼脂，加热溶化，然后参加指示剂，混匀后分装试管，12115min。配制养清楚胶培育基〔%〕pH~耐盐培育基〔%〕：1牛肉膏2～蒸馏水1牛肉膏10～蒸馏水1牛肉膏20～蒸馏水1牛肉膏25～蒸馏水15%2mL，校正pH至～。参加琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。溶液或试剂染料革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀绿溶液,石炭酸复红液;香柏油、二甲苯吲哚试验：乙醚、吲哚试剂.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚，淀粉酶活力测定：1%3,5-二硝基水杨酸试剂仪器或其它用具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培育皿土样三角瓶烧杯洗瓶五、试验方法及步骤1、初筛方法1、初筛方法①制菌悬液5g45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,10-112个，4AB。②加热筛选有芽孢的菌2个锥形瓶加塞、包扎、摇匀〔无菌室里〕，利用10015min〔制悬液时就应先开头加热〕，10-1g/ml的土壤悬液③梯度稀释菌悬液：再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液参加10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液参加编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5土壤稀释液。在土壤稀释过程中，用一样的移液枪头由浓到稀来稀释。④涂布平板用一支的无菌枪头，由低浓度开头，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培育基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个浓度做3个平板〔重复〕。37℃下恒温培育24h。2、复筛方法划线接种〔分区划线法〕：在上述不同稀释度培育基中挑取不2、复筛方法划线接种〔分区划线法〕：在上述不同稀释度培育基中挑取不同形态的单菌落进展分区划线，先在平板培育基的一边作第1次平行划线3~4条，再转动培育皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线局部作第2次平行划通过第3次平行划线局部作第4次平行划线〔如右图〕。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29°C温室中培育约20h.。再连续分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。菌种，另一局部用来做染色试验。3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不全都的点接于倒好的淀粉牛肉膏培育基85个区3724h。室，其他置于无菌室。试验室里，四个平板均参加碘液，马上观看记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透亮圈的大小。依据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的养分琼脂平板上其对应的菌落连续划线接种，培育后将消灭的形态特征不全都的菌落进展编号，然后挑取局部出来进展革兰氏染色镜检，假设觉察视野内消灭形态、大小、颜色全都且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到的养分琼脂平板上，标记，3724h。否则连续进展划线分别，培育后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进展芽孢染色。筛选出芽孢纯种后进展斜面接种。革兰氏染色步骤：涂片、枯燥及固定1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。1分钟，后水洗。脱色：除去残水后，滴加95%酒精进展脱色约15－20秒，后马上用流水冲洗。3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。镜检：油镜观看染色结果。：·取37℃培育18～24h的枯草芽孢杆菌涂片，枯燥，固定。·于涂片上滴人3～55%孔雀绿水溶液。4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。·倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。·lmin，水洗。·制片枯燥后用油镜观看。芽孢呈绿色，菌体红色。〔注：观看芽孢的外形和位置，查伯杰细菌手册〕斜面保存菌种·贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。〔每种菌接3管，标上一样编号也要与平板上菌落编号相对应〕。进展斜面接种操作，加塞、包扎好到37℃培育箱里培育24h。5、菌种的鉴定的大小、颜色、干湿状况、形态、高度、透亮程度、边缘、是否易被挑起、〔具体步骤同上〕观看是否符合附表中芽孢杆菌的指标生理生化试验温度对菌种培育的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。·温度对微生物生长的影响将牛肉膏蛋白胨培育基熔化倒平板。〔2倍〕取30套牛肉膏蛋白胨平板，分别进展标号。 板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。各取每个菌种两套平板倒置于4℃〔冰箱〕、37℃〔或者室温〕，60℃下保温培育24小时，观看细菌的生长状况。〔“—”不生长，“+”生长较差，“++”生长一般，“+++”生长良好。·淀粉水解试验以18-24h的纯培育物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板〔一个平板可分区划“+“字接种，〕或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培育24-48h，或于20℃培育5天。然后将碘试剂直接滴浸于培育外表，假设为液体培育物，则加数滴碘试剂于试管中。马上检视结果，阳性反响〔淀粉被分解〕为琼脂培育基呈深蓝色、菌落或培育物四周消灭无色透亮环、或肉汤颜色无变化。阴性反响则无透亮环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进展的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的力量、培育时间，培育基含有淀粉量和pH等均有肯定关系。培育基pH必需为中性或微酸性，以最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。·糖类发酵试验〔葡萄糖、木糖和乳糖发酵〕名称。用接种针将各种杆菌分别接种于两种发酵管内，每种发酵管重复两次，标记，要与斜面菌种标记相对应。两种发酵管各设一支不接种，作为空白对小烧杯内，3724h。观看记录：与比照管比较，假设接种培育液保持原有颜色，其反响结果为阴性，说明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培育液呈黄色，反响结果为阳性，说明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培育液中的杜氏小管内有气泡为阳性反响，说明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反响，记录用“－”。·乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)接种培育3724h。观看记录取出以上试管，充分振荡2min。每管分别参加40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，假设培育液呈红色，记录为.试验阳性反响〔用“＋”表示〕；假设不呈红色，记录为.试验阴性反响〔用“－”表示〕。·吲哚试验试管标记接种培育3724h。观看记录在培育液中参加乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置5～10滴吲哚试剂〕，如有吲阳性用“＋”、阴性用“－”表示。·耐盐性试验将分别获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，10%，20%，25%，的牛·柠檬酸盐试验37℃恒温箱中24h。观看结果，假设培育基变蓝色，则说明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性反响，以“＋”表示。假设培育基仍为绿色则为阴性反响，以“－”表示【8】。6、产淀粉酶芽孢杆菌产淀粉酶活性的测定发酵：将初筛纯菌种接种于30/250mL种子培育基,37℃、250r/min摇床培育过夜。种子液以2%接种量接种于产酶液体培育基50/500mL,一样条件培养72h,发酵8000r/min，离心10min,取上清液测酶活,每个样品重复3次,最终结果取平均值。在Young等方法的根底上作了改进：取5ml%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中预热10min，然后加适当稀释的酶液，反响5min后，用5mlLH2SO4终止反响。取反响液与5ml碘液显色，在620nm处测光密度。以水代替反响液为空白，以不加酶液〔加同样体积的缓冲液〕的管为比照。酶活力依据下式计算：酶活力〔u/ml〕=(R-r)/R*50*D式中R、r分别表示比照和反响液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D使〔R-r〕/R在之间。确定在40℃5min内水解1m