探讨肺腺癌组织mRNA在信号通路中的调控作用,肿瘤学论文

探讨肺腺癌组织mRNA在信号通路中的调控作用,肿瘤学论文肺腺癌是肺癌当中最常见的一种，也是死亡率很高的一种癌症，通常5年生存率只要15%[1].通过对肺腺癌发生与进展中一些关键信号通路的研究，能够帮助寻找到高效的分子靶向抗癌药物。我们利用全基因组表示出谱芯片，挑选肺腺癌与癌旁组织中差异表示出的mRNA,并分析其介入的信号通路变化，讨论mRNA在信号通路中的调控作用。1材料与方式方法1.1标本来源所有6例肺腺癌组织标本均来源于2018年4月到2018年5月武汉大学中南医院胸心外科手术切除标本，所有病人标本均为术前未行放疗或化疗，术后病理确诊为肺腺癌的肿瘤组织〔T〕和癌旁正常组织〔N〕的液氮冻存标本。所有标本采集均经过患者家属签属知情同意，并经医院伦理委员会审核通过。所有标本均于肿瘤离体后15min内获取。1.2一般材料TRIzol试剂〔Invitrogen生命科技公司〕，ds-cDNA合成试剂盒〔Invitrogen生命科技公司〕，单色DNA标记试剂盒〔美国NimbleGen公司〕，含有19000条mRNA的全基因组表示出谱芯片〔上海康成生物技术公司〕。1.3实验方式方法①RNA制备使用TRIzol试剂相位分离并提取组织总RNA.②RNA含量和质量控制：使用紫外光吸收测定法，利用NanoDropND-1000测定RNA浓度和纯度。使用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完好性。③双链cDNA合成、洗脱及析出：使用Invitrogen试剂盒，根据讲明书将提取的5g总RNA合成为ds-cDNA.参加4g的RNA酶A溶液，轻度振荡后在37℃下孵育10min,向含有RNA酶A的ds-cDNA中参加163l苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，涡旋机上涡旋。将上述试剂转移到相位锁定管中，12000g下离心5min.小心转移上清液至干净的1.5ml离心管中，即得到无RNA的ds-cDNA.以冷无水乙醇析出沉淀并用NanoDropND-1000定量。④样品标记：将1吸光度单位的Cy3-9荧光素加到1g双链cDNA中，98℃下孵育10min.参加100pmoldNTP和100U克列诺片段并混匀，37℃孵育2h,参加0.1体积EDTA终止反响，异丙醇纯化已标记的ds-cDNA.⑤杂交和洗涤：取4g已标记ds-cDNA参加Nim-bleGen杂交缓冲液，于42℃下在杂交系统中反响16-20h.之后用冲洗缓冲液洗涤。⑥扫描结果：AxonGenePix4000B扫描杂交后所得芯片，Gene-PixproV6.0读取原始图像。所得图像输入Nim-bleScansoftware〔version2.5〕进行表示出数据分析，用分位数和强多芯片平均法对基因表示出数据进行归一化。所有mRNA数据由AgilentGeneSpringGX软件进行进一步分析。对基因表示出数据进行非监督分层聚类分析〔UnsupervisedHierarchicalCluste-ring〕，并对基因进行信号通路分析。2结果2.1总RNA、ds-cDNA与标记DNA的质量与纯度通过NanoDropND1000分析，6组样品中总RNA、ds-cDNA与标记DNA的OD260/OD280Ratio值均在1.8-2.0之间，OD260/OD230Ratio值均大于1.8〔表1〕。琼脂糖凝胶电泳示总RNA的28S、18S条带清楚明晰，且28S条带亮度在18S条带的两倍以上，5S条带模糊。该结果显示所得RNA质量和纯度可知足实验要求，用于下步实验。2.2mRNA非监督分层聚类分析图1显示，根据mRNA的表示出情况，6例标本被分为两大类，与肺癌组织和癌旁组织的分类相符，讲明差异表示出的mR-NA具有肿瘤组织特异性，即有大量的mRNA在肿瘤中发生了高表示出或低表示出。2.3mRNA在肿瘤组织中的差异表示出情况==在mRNA火山图〔图2〕中，以T-test显着检验P值的负对数-log10〔P-Value〕为纵坐标，以log2〔倍数变化〕为横坐标。则图中红点表示在统计学上为差异表示出2倍以上且P0.05的mRNA.检测后发现，发现发生显着差异表示出〔大于2倍变化且P0.05〕的mRNA共832条，华而不实T相对N高表达的mRNA407条。基因序号为NM-006926的mRNA在肿瘤中的表示出量为正常组织中的58.69倍〔P=0.026〕，序列号为NM-000900的mRNA在肿瘤组织中的表示出量为正常组织中的43.69倍〔P=0.026〕，序列号为NM-138455的mR-NA在肿瘤组织中的表示出量为正常组织中的28.75倍〔P=0.038〕。表2列举了相对高表示出的407条mRNA中的20条的情况。T相对N低表示出的mR-NA有425条。其中基因序号为NM-057182的mRNA在癌旁组织中的表示出量为肿瘤组织中的17.49倍〔P=0.023〕，序号为NM-002639的mRNA在癌旁组织中的表示出量为肿瘤组织中的15.85倍〔P=0.049〕，序号为NM-153246的mRNA在癌旁组织中的表达量为肿瘤组织中的10.52倍〔P=0.023〕，序号为NM-214462的mRNA在癌旁组织中的表示出量为肿瘤组织中的10.33倍〔P=0.0231表3列举了相对低表示出的425条mRNA中的20条的表示出情况。2.4信号通路分析==信号通路分析有助于研究者寻找在肿瘤中发生显着变化的信号通路，并进一步探寻求索华而不实被调节的基因和蛋白。分析软件将所检测到有统计学意义的差异表示出mRNA与信号通路库〔KEGG〕比照扫描，富集度分析发现有9种信号通路中的基因或蛋白发生了上调或下调表示出〔图3〕〔P0.05〕。我们选择以为与NSCLC相关的5条信号通路进行描绘叙述。2.4.1同源重组信号通路Rad50、Rad54和DNA聚合酶〔pol〕表示出下降。2.4.2人转化生长因子-信号通路凝血酶敏感素1基因〔thrombospondin-1,THBS1〕表示出上调，smad锚着受体激活蛋白〔Smadanchorforreceptoractivation,SARA〕表示出下降。2.4.3丝裂原活化蛋白激酶〔MAPK〕信号通路FGF、RasGFR、Rap1、FLNA、HSP72、NFAT-4和JunD等表示出上调；CACN、Cap1m、IKK、MNK1/2、MKP〔MAPKphosphatase,MAPK磷酸酶〕、GLK、JNK、MKP和MSK1/2表示出下降。2.4.4细胞周期信号通路Cdc14和磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸结合蛋白等基因表示出上调；细胞周期蛋白E〔CycE〕，细胞周期蛋白依靠激酶1〔CDK1〕，起始辨别复合体〔originrecognitioncomplex,ORC〕、微小染色体维持基因〔mini-chromosomemainte-nance,MCM〕,Chk1,2,BubR1,Cdc25B,C等表示出下降。2.4.5p53信号通路IGF表示出上调；周期蛋白E和Cdc2、Maspin表示出下降。3讨论肺癌是人类最常见的致死性恶性肿瘤。肺癌的发生有多种蛋白质编码基因和调控基因的介入，当前对肺癌的编码基因已经有了较为深切进入的了解，但对肺癌的调控网络还需要进一步研究[2,3].运用高通量人类基因表示出谱芯片检测样品中的基因表示出情况，随后对其进行基因语义分析、信号通路分析等，有助于分析肺癌的调控网络，进而寻找到高效抗癌靶向药物。这也是当前常用的一种癌症研究方式方法。在本次试验中，我们收集了6例肺腺癌肿瘤标本，采用高通量全基因组基因芯片，挑选出差异表示出〔大于2倍变化且P0.05〕的mRNA共832条。华而不实T相对N高表示出的mRNA407条，T相对N低表示出的mRNA有425条。这些差异表示出的mR-NA分子可能通过被激活或抑制，改变了一些肿瘤相关信号通路的作用，进而促进了肺腺癌的发生与发展。通过分层聚类分析，我们发现了差异表示出的mRNA分类与肺腺癌和癌旁组织分类相符。这也从另一个角度证明了差异表示出的mRNA与肺腺癌发生的相关性。差异基因中有的是控制癌变的驱动基因，有的是驱动基因下游基因，挑选并确认驱动基因有待进一步工作完成。通过对这些差异表示出的mRNA与信号通路库〔KEGG〕进行比照扫描，我们发现与肺腺癌发生经过中关系比拟密切的5条信号通路，并对一些关键性的差异表示出基因在5条信号通路中的作用进行初步分析。如在人转化生长因子-信号通路中，凝血酶敏感素1〔Thrombospondin-1,THBS1〕能够作为TGF-通路的起始刺激物上调癌细胞的uPA和PAI1基因表示出，还能与TGF-共同作用于金属蛋白酶并影响其活性。本研究发现在肺腺癌中THSB1的表示出上调，提示其可能通过激活了TGF-通路而促进肺腺癌的发生；在p53介导的细胞周期停止进程中，细胞周期蛋白E的表示出是该经过正常进行的必要条件之一，CycE在细胞周期中的主要作用是促进细胞G1期的进展，同时还在细胞凋亡中起正性调节作用。本研究结果显示在NSCLC中，CycE的表示出下降，使p53抑制肿瘤细胞周期进展的作用失败，引起了肿瘤细胞的增殖。通过我们的分析工作，一方面为将来寻找肺腺癌的靶向治疗提供了捷径，另一方面也为其他研究癌症信号通路的工作者提供了丰富的研究素材。另外，我们之前已通过高通量基因芯片，研究了肺腺癌与癌旁组织标本中长链非编码RNA〔longnon-codingRNA,lncRNA〕的差异表达情况[4,5].结合本次的实验结果，我们能够得到一些新的启示：lncRNA作为一种调控基因，能够通过对mRNA编码基因的调控作用，促进肺腺癌的发生。在本次发现的与肺腺癌发生密切相关的5个信号通路中，一些差异表示出的mRNA分子，无论是在位置和作用功能上，均与上次芯片分析所得的差异表示出lncRNA结果相偶合。结合两次芯片分析结果，我们产生了一些这样的假设：如在同源重组信号通路中，最上游的Rad50被某一lncRNA调控后表示出遭到抑制，进而引起下游Rad54和DNA聚合酶表示出的下调。另外，可以能存在其他的一些lncRNA分子，通过抑制DNA聚合酶的活性或调整其构象，进而导致DNA聚合酶的下调表示出；在p53信号通路中，Maspin的表示出下降受IncRNA的调控，之前已有研究发现了Maspin的受p53依靠和非p53依靠的表观遗传学调控[6].因而我们以为，在肺腺癌的发生中，Maspin的抗血管生成和抗转移作用被抑制可能与lncRNA的表观遗传调节作用有关。以下为参考文献[1]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin,2018,61〔2〕:69-90.[2]BootonR,LindsayMA.EmergingroleofMicroRNAsandlongnoncodingRNAsinrespiratorydisease[J].Chest,2020,146〔1〕:193-204.[3]周雪峰，王乐，张力，等.N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ在CD133+人肺腺癌细胞中的表示出和功能研究[J].武汉大学学报：医学版，2018,32〔5〕:589-592.[4]周雪峰，但攀，朱明林，等.肺腺癌组织与肺癌组织长链非编码RNA表示出谱的挑选[J]1中华实验外科杂志，2020,29:1489-1490.[5]ZhangLi,ZhouXF,PanGF,etal.Enhancedexpres-sionoflongnon-codingRNAZXF