常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学

常用分子生物学技术的原理及其应用级临床医学第一页，共二十五页，2022年，8月28日概述(一)分子杂交与印迹技术在DNA复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件下，就可以在不同的分子间形成杂化双链。这种现象称为核酸分子杂交。将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术。第二页，共二十五页，2022年，8月28日(二）聚合酶链式反应（PCR）

PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR常与其它技术如分子杂交，限制酶酶谱分析，单链构象多态性检测，限制性片段长度多态性分析，DNA序列测定等联合应用。（三）单链构象多态性

单链构象多态性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCR—SSCP技术。第三页，共二十五页，2022年，8月28日（四）限制酶酶谱分析基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。（五）DNA序列测定

DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位的突变的性质。（六）DNA芯片技术应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。第四页，共二十五页，2022年，8月28日第一节分子杂交与印迹技术、探针技术

第五页，共二十五页，2022年，8月28日一、分子杂交与印迹技术的原理第六页，共二十五页，2022年，8月28日在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交(hybridization)第七页，共二十五页，2022年，8月28日(一)印迹技术将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术（blotting）。第八页，共二十五页，2022年，8月28日分子印迹(渍)的概念。将凝胶中的DNA片段变性使其成为单链，然后再将一张硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。载有DNA单链分子的NC膜就可以在杂交液与另一种带有标记的DNA或RNA分子(即探针)进行杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称为印迹技术。第九页，共二十五页，2022年，8月28日(二)探针技术第十页，共二十五页，2022年，8月28日

探针(probe)

一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。因此印迹技术与探针技术往往同时使用。第十一页，共二十五页，2022年，8月28日

分子杂交、印迹技术、探针技术实验①②③目录第十二页，共二十五页，2022年，8月28日二、印迹技术的类别及应用DNA印迹技术

(Southernblotting)

RNA印迹技术

(Northernblotting)

蛋白质的印迹分析

(Westernblotting)

第十三页，共二十五页，2022年，8月28日(一)DNA印迹技术(Southern印迹法)

DNA印迹技术是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量，可用于:

基因的酶切图谱分析、基因突变分析、基因组基因的定性及定量分析、限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。为了纪念Southern先生，以其姓氏称DNA印迹技术为Southernblotting(Southern印迹法)。第十四页，共二十五页，2022年，8月28日(二)RNA印迹技术(Northernblotting)

用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。其基本原理与DNA印迹技术类似。第十五页，共二十五页，2022年，8月28日(三)蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。

第十六页，共二十五页，2022年，8月28日三种印迹技术第十七页，共二十五页，2022年，8月28日放射自显影照片目录第十八页，共二十五页，2022年，8月28日第二节

PCR(聚合酶链式反应)技术的原理与应用第十九页，共二十五页，2022年，8月28日1993年美国科学家穆利斯(K.Mullis)因发明“聚合酶链式反应”法，在遗传领域研究中取得突破性成就、加拿大籍英裔科学家史密斯因开创“寡聚核甙酸基定点诱变”方法而共同获得诺贝尔化学奖。第二十页，共二十五页，2022年，8月28日问题的提出？在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵。

第二十一页，共二十五页，2022年，8月28日发现耐热DNA聚合酶—Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

第二十二页，共二十五页，2022年，8月28日一、PCR技术的工作原理PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；第二十三页，共二十五页，2022年，8月28日③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就