第四章紫外可见分光光度法

三、吸光系数

吸光系数k的物理意义为：液层厚度为1cm的单位浓度溶液的吸光度，它表示物质对特定波长光的吸收能力。一个物质在一定条件下的吸光系数为定值。通常有两种表示方法：

摩尔吸光系数ε

百分吸光系数

吸光系数k

物理意义是指样品浓度为1mol·L-1的溶液置于1cm样品池中，在一定波长下测得的吸光度值。量纲为L·mol-1·cm-1

。ε104102中强吸收弱吸收强吸收（一）摩尔吸光系数ε（二）百分吸光系数

物理意义是指溶液浓度在1%（1g/100mL），液层厚度为1cm时，在一定波长下的吸光度值。量纲为100mL·g-1·cm-1。

百分吸光系数和摩尔吸光系数有如下关系：

例4-1用氯霉素（分子量为323.15）纯品配制100mL含2.00mg的溶液，使用1.00cm的吸收池，在波长为278nm处测得其透射率为24.3%，试计算氯霉素在278nm波长处的摩尔吸光系数和比吸光系数。解：已知λ=278nmM=323.15g/mol

c=2.00×10-3%T=24.3%

S2S1S0hAhhh吸收光谱四、吸收光谱测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。它清楚地描述了溶液对不同波长的光的吸收情况。从吸收曲线可以得到什么？1.同一浓度的有色溶液对不同波长的光有不同的吸光度;2.对于同一有色溶液，相同的入射光波长，浓度愈大，吸光度也愈大；

3.对于同一物质，不论浓度大小如何，最大吸收峰所对应的波长(最大吸收波长λmax)不变.并且曲线的形状也完全相同。4.吸收曲线可作为吸光光度法中波长选定的依据，测定时一般选择λmax

的单色光作为入射光。邻菲罗啉－亚铁溶液的吸收曲线浓度大小：Ⅰ>Ⅱ>ⅢⅠⅡⅢ讨论：定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。AC增大§2.2光度计及其基本部件1.分光光度计分光光度计9.2.1基本组成光源单色器样品室检测器显示2.2.2主要部件1.光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢、氘灯。发射180～375nm的连续光谱。2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任意波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光;棱镜或光栅3.样品室

样品室放置各种类型的吸收池(比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测系统

将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。(1)光电管(2)光电二极管阵列电容器再次充电的电量与每个二极管检测到的光子数目成正比，而光子数又与光强成正比。通过测量整个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。电容器充电电容器放电光照射再次充电测量周期§4.3分析条件的选择分析条件的选择测量波长狭缝宽度吸光度的范围仪器条件的选择显色剂反应的要求显色条件的选择溶剂参比溶液试剂参比溶液样品参比溶液平行操作参比溶液参比溶液显色条件选择

一、仪器条件的选择

（一）测量波长

通常选择最强吸收峰的最大吸收波长λmax为入射波长。在该波长处，吸收度大，灵敏度较高。

如在该波长有干扰，可选次强吸收峰的最大吸收波长λmax

为吸收波长

（二）狭缝宽度

狭缝宽度灵敏度↓↑↓↑通常选在不减少吸光度时的最大狭缝宽度为适宜的狭缝宽！光线谱带变窄；光线强度减弱光线谱带变宽；光线强度增加变窄变宽

（三）吸光度的范围当吸光度A在0.3～0.7范围内时，实验的测量误差较小。通常实验时，将吸光度的测量范围控制在0.2～0.8内。

如果待测组分本身没有颜色或本身颜色很浅，那么就无法直接进行测定，需利用显色反应将待测组分转变为有色物质，然后进行测定。这种将试样中待测组分转变成有色化合物的化学反应，叫显色反应。与待测组分形成有色化合物的试剂叫显色剂。

二、显色条件的选择

例如：Fe2+本身颜色很弱。如加入显色剂邻二氮菲，则生成稳定橙红色络合物，该络合物吸光能力强，用于含量测定效果佳。

（一）显色剂反应的要求

1.显色反应灵敏度高显色反应产物的ε愈大，灵敏度愈高；

2.显色剂选择性高显色剂应尽量只与待测组分反应，而不与溶液中其他共存组分反应。3.显色剂的对照性要高

显色剂的颜色应与显色反应产物的颜色有较大区分，使实验结果更为准确；4.显色产物稳定显色反应产物应有一定的稳定性。（二）显色条件的选择

1.显色剂浓度及用量

最适宜显色剂浓度及用量可通过实验确定。

2.溶液pH

显色剂一般本身为弱酸或弱碱，溶液的pH值可显著影响显色剂的解离程度和显色反应的完成程度。可通过实验确定最合适pH。3.显色反应的时间和温度

显色反应一般需要一定时间，显色程度会随着时间变化而变化。可作显色反应时间-吸光度曲线，最合适的时间为曲线中的平坦部分3.显色反应的时间和温度

显色温度通常选在室温下进行，有的显色反应发生较慢，可适当升高温度。灵芝多糖溶液加入显色剂后的时间-吸光度曲线1.溶剂参比溶液当样品简单，无显色剂或显色剂无吸收，直接用溶剂作参比溶液。2.试剂参比溶液对于显色反应，显色剂如有吸收，可在溶剂中加入与样品溶液相同含量的显色剂的溶液作参比溶液。

三、参比溶液

3.样品参比溶液对于样品较为复杂的显色反应，可用不加显色剂的样品溶液为参比溶液。4.平行操作参比溶液

若显色剂、样品溶液中各组分均在设定波长下有吸收，则可采用显色剂与除待测组分外的其他共存组分混合作为参比溶液。§4.4紫外-可见分光光度法的应用定性分析定量分析应用光谱对照特征数据比较吸光度比值的比较单一组分的测定多组分的测定

一、定性分析1.光谱对照同样条件下测定待测物和标准物的吸收光谱，如果两者吸收光谱一样，可认为是同一物质。如无标准物，也可比较标准谱图集里的光谱。2.特征数据比较最大吸收波长λmax和吸光系数，是用于定性鉴别的主要光谱数据。3.吸光度比值的比较

有些物质的光谱上有几个吸收峰，可在不同的吸收峰（谷）处测得吸光度的比值作为鉴别的依据。

二、定量分析

定量分析的依据是1.单一组分的测定（1）吸光系数法查得吸光系数后根据吸光度求得样品浓度

例4-5已知维生素B12在361nm处的百分吸光系数为207。精密称取样品30.0mg，加水溶解后稀释至1000mL，在该波长处用1.00cm吸收池测定溶液的吸光度为0.618，计算样品溶液中维生素B12的质量分数。解：已知A=0.618,=207,l=1.00cm由A=klc样品中维生素B12含量为

（2）标准比对法相同条件下，分别配制待测溶液X和标准溶液S，并分别测定吸光度。根据郎伯-比尔定律，可写出例4-6为测定维生素B12原料药含量，准确称取试样25.0mg，用蒸馏水溶解后，定量转移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度后，摇匀。另称取同样重量的B12标准品，用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml，摇匀。在361nm波长处，用1cm比色皿分别测得样品溶液和标准品溶液的吸光度分别为0.512和0.518。求试样中B12的百分含量。解：已知Ax

=0.512As

=0.518两溶液配制、稀释方法一致（3）标准曲线法用标准曲线法测铁的浓度为例：①配一系列浓度的标准铁溶液，依次测定吸光度②作c-A图，即标准曲线③将待测溶液吸光度AX代入标准曲线，读出浓度三磺基水杨酸合铁配合物波长420nm2.多组分的测定当溶液内有两个及以上组分并需测得各自含量时，就是多组分的测定。（a）吸收光谱互不重叠（b）吸收光谱部分重叠（c）吸收光谱相互重叠（1）吸收光谱互不重叠此种情况下可以按单组分测定的方法分别求得各个组分浓度（2）吸收光谱部分重叠例如右图，可先在无干扰处λ2求得a的浓度，再求得b的浓