分子生物学：翻译-精简版

第四章

生物信息的传递（下）

——从RNA到蛋白质一、遗传密码和翻译系统（一）遗传密码的破译1954年G.Gamov对破译密码首先提出了设想若一种碱基对应与一种氨基酸，那么只可能产生4种氨基酸;若2个碱基编码一种氨基酸的话，4种碱基共有42=16种不同的排列组合;3个碱基编码一种氨基酸，经排列组合可产生43=64种不同形式若是四联密码，就会产生44=256种排列组合三联密码的证实（1）1961年Crick和Brenner.S等证实了三联密码的真实性。他们用T4染色体上的一个基因（rⅡ位点）通过用原黄素（proflavin）处理，可以使DNA脱落或插入单个碱基，插入叫“加字”突变，脱落叫“减字”突变.无论加字和减字都可以引起移码突变。Crick小组用这种方法获得一系列的T4“加字”和“减字”突变，再进行杂交来获得加入或减少一个，二个，三个的不同碱基数的系列突变。通过这样的方法他们发现加入或减少一个和二个碱基都会引起移码突变，而加入或减少3个碱基时反而可以恢复正确的读框，表明每个密码子的确是由3个碱基组成的。在这篇文章中Crick对遗传密码提出了4个特点：3个碱基一组，编码一个氨基酸密码是不重叠的；碱基的顺序从固定起点解读,即mRNA具有固定的阅读框；密码子是简并（degeneracy）的,即某个特定的氨基酸可以由几个密码子来编码。三联密码的证实（2）

——利用突变来解读密码1960，A.Tsugita，H.Fraenkel-Connrat小组和H.G.Wittmann小组试图通过用亚硝酸来对TMV进行诱变。当时根据亚硝酸诱变的原理，mRNA中的A→G或C→U。当时已搞清了TMV肽链的一级结构由159个氨基酸组成将突变型和野生型进行比较就能确定肽链上氨基酸取代的位点和类型。他们一共获得了约200个突变株，经反复比较分析结果破释了少数几个密码子，但他们直接地证实了密码子是不重叠的。若当时可以测序的话，用这一方法是可以破译所有的密码子。三联密码的证实（3）

——无细胞系统的建立1955S.Ocha在细菌中分离了多核苷酸磷酸化酶（polynucleotidephosphorylase）,它催化核糖核苷二磷酸的聚合，它不需要任何DNA模板就可合成.1961年Nirenberg在多核苷酸磷酸化酶发现的基础上建立了无细胞系统。具体方法是:去模板：用DNAase处理E.coli抽提物，使DNA降解，除去原有的细菌模板。加入polU：合成了多聚苯丙氨酸，这一结果不仅证实了无细胞系统的成功，同时还表明UUU是苯丙氨酸的密码子。分别加入polyA，polyC

和polyG

结果相应地获得了多聚赖氨酸，多聚脯氨酸和多聚甘氨酸。由于当时还未分离RNApol酶，无法按设计的模板来合成RNA，Nirenberg又想出了一种新的方法，就是按一定的碱基比例来合成RNA。按比例加入２种核苷混合的多聚物比如在底物中加5份的UDP和1份的GDP，碱基比为U：G＝5：1，它们能组成8种三联体：

UUU，UUG，UGU，GUU，GGG，GGU，GUG，UGG。U和G将随机地加入到三联体中，这样按比例各个位子上进入U和G的概率不同，如氨基酸测定结果：UUU：UGG＝（555）:（511）＝25:1同理UUU：UUG＝5:1，根据检测结果推测:苯丙氨酸（UUU）：半胱氨酸（UGU）＝5:1苯丙氨酸（UUU）：缬氨酸（GUU）＝5:1苯丙氨酸（UUU）：甘氨酸（GGU）＝25:1苯丙氨酸的密码子是已知的，由3个U组成那么:半胱氨酸一定是由2个U，1个G组成；缬氨酸同样如此；甘氨酸应是由一个U两个G组成。Ochoa,S.及其合作者也采用该方法，两组展开了激烈的竞争，经过两个组一年多的努力，结果搞清了各种氨基酸的碱基组成。但是并不知其顺序。Nirenberg于1964年又采用三联体结合实验，一举破译了所有密码，取得了重大的突破。三联密码的证实（4）

——三联体结合实验1964年Nirenberg又采用三联体结合实验，这个方法的思路是建立在两项基础上的：tRNA和氨基酸及三联体的结合是特异的；上述结合的复合体大分子是不能通过硝酸纤维滤膜的微孔，而tRNA-氨基酸的复合体是可以通过的。三联密码的证实（5）

——利用重复共聚物Khorara采用了有机合成一条短的单链DNA重复顺序，然后用DNApolI合成其互补链，再用RNApol及不同的底物合成两条重复的RNA共聚物，作为翻译的mRNA，加入到体外表达系统中。用二个或三个、四个核苷酸构造重复共聚体来确定密码子重复顺序可组成的三联密码多肽的氨基酸组成(UC)nUCU-CUCSer-Leu(UUC)n(UUC);(UCU);(CUU)polyPhe,polySer,polyLeu(UUAC)n(UUA-CUU-ACU-UAC)Leu-Leu-Thr-TyeKhorana就用这种方法将所有的遗传密码都破译了。这项实验还同时证实了：三联密码的正确性，以及兼并的存在。

三联密码的证实（5）

——利用重复共聚物各种氨基酸密码子的数目和氨基酸在蛋白质中出现的频率不成正比终止密码子的确定

1964年Yanofsky在研究E.coli色氨酸合成酶A蛋白时推测无义密码子(nonsensecodons)（即终止密码子）的存在。1965年Weigert,M.和Garen,A由碱性磷酸酶基因中色氨酸位点的氨基酸的置换证明E.coli中无义密码子的碱基组成揭示了琥珀和赭石（ochre）突变基因分别是终止密码子UAG和UAA。终止密码子的确定1967年Brenner和Crick证明UGA是第三个无义密码子。根据无义突变的三种昵称，三个终止密码子：UAA叫赭石（ochre）密码子（相应于赭石突变）；UAG叫琥珀(amber)密码子（相应于琥珀突变）；UGA叫蛋白石（opal）密码子（相应于蛋白石突变）或乳白密码子。起始密码子的确定

在Nirenberg的三联体结合实验和Khorana的重复共聚物的体外翻译实验中。合成能从任何碱基起始。但在体内却并非如此，而是需要一个起始密码子(initiatorcodons)。将各种蛋白质的氨基酸顺序和其编码顺序相比较，起始时都是AUG密码子，读码也都相同，在原核细胞中它编码甲酰甲硫氨酸，在真核细胞中编码未经修饰的甲硫氨酸。当正常的AUG起始密码子缺失时，GUG也为起始密码子。但在离体条件下GUG的起始翻译的效率要比AUG低得多，可能因为它和甲酰甲硫氨酸-tRNA的亲和力较低，这也可以作为调控该基因表达的一种手段。（二）遗传密码的特点遗传密码是三联体密码。遗传密码无逗号。遗传密码是不重迭的。遗传密码具有通用性。遗传密码具有简并性(degeneracy(synonyms)。密码子有起始密码子和终止密码子。反密码子中的“摆动”（wobble）摆动假说(wobblehypothesis)是由Crick.F（1966年）提出的。即当tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对时前两对严格遵守碱基互补配对法则，但第三对碱基有一定的自由度可以“摆动”。摆动假说也称为三中读二（2outof3reading）遗传密码中的摆动反密码子5′端密码子3′端可配对碱基GU或CCGAUUA或GI（次黄嘌呤）A、U或C有义密码子(sensecodons)虽有61个，但反密码子由于的摆动可能少于61个。原核和真核细胞都只有约30种反密码子

三中读二一般可分为三种情况：第１,２两个碱基形成６个氢键时，可三中读二。如ＣＣＸ，ＣＧＸ，ＧＣＸ和ＧＧＸ。第1,2两个碱基形成4个氢键时,不可三中读二。如AAX，ＡＵＸ，ＵＡX和ＵＵＸ。第１，２两个碱基形成５个氢键时,当第二个碱基为嘧啶时，可三中读二；如ＵＣＸ，ＡＣＸ，ＣＵＸ和ＧＵＸ。当第二个碱基为嘌呤时则不能三中读二，如ＣＡＸ，ＧＡＸ，ＵＧＸ和ＡＧX。（三）tRNA的结构和功能

（一）三叶草型的二维结构tRNA的长度范围一般为74~95个碱基，其中22个碱基是恒定的。5’端和3’端配对（常为7bp）形成茎区，称为受体臂（acceptorarm）或称氨基酸臂。在3’端永远是4个碱基（XCCA）的单链区，在其末端有2’-OH或3’-OH，是被氨基酰化位点。此臂负责携带特异的氨基酸。

TψC常由5bp的茎和7Nt和环组成。此臂负责和核糖体上的rRNA识别结合；反密码子臂(anticodonarm)常由5bp的茎区和7Nt的环区组成，它负责对密码子的识别与配对。D环(Darm)的茎区长度常为4bp，也称双氢尿嘧啶环。负责和氨基酰tRNA聚合酶结合;额外环(extraarm)可变性大，从4Nt到21Nt不等，其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域（D环－反密码子环和TψC-受体臂）。三叶草型的二维结构氨基酸受体臂位于L型的一侧，距反密码子环约70ǺD环和TψC环形成“L”的转角抑制子tRNA在分析tRNA与mRNA上密码子的作用能力和检测tRNA分子上不同部位对密码子－反密码子的识别作用时，经常会用到分离突变的tRNA的方法。有些tRNA的突变体能抑制蛋白质编码基因中的突变所造成的影响，我们把这种突变的tRNA称为抑制子tRNA。在tRNA抑制系统中，最初的突变改变了mRNA上的密码子，使产生的蛋白质不再有功能。随后，抑制突变改变了tRNA上的反密码子，使它能够识别突变的密码子而不是(或也能)识别它最初的靶密码子。这时插入的氨基酸又恢复了蛋白的功能。依据最初突变的性质，把这种抑制子称为无义抑制子(nonsensesuppressor)或是错义抑制子(missensesuppressor)。无义抑制错义抑制（四）氨基酰-tRNA的形成氨基酸进入蛋白质合成途径是通过氨基酰-tRNA合成酶，这种酶将氨基酸和特异的tRNA连接起来。通过构象、反应动力学及化学等不同途径分别对tRNA和氨基酸进行鉴别校对。氨基酰-tRNA合成酶将tRNA和氨基酸分成相应的组，每种合成酶都能识别单一的氨基酸和所有能携带它的tRNA，然后将相应的氨基酸和tRNA装配起来。携带同种氨基酸的不同tRNA称为同工tRNA(isoacceptingtRNA）。因为它们被同一个合成酶识别，所以也称为同族tRNA（cognatetRNA）。氨基酰-tRNA的形成氨基酰-tRNA合成酶氨酰tRNA合成酶的校读功能tRNA和合成酶的结合通过两步反应来进行，相关tRNA对结合位点有很高的亲和性，因此结合较快，解离较慢。随着tRNA的结合，此酶就要“审查”这个被结合的tRNA。若是正确的tRNA，那么通过酶构象的改变使结合更为稳定。接着迅速的发生氨基酰化。若是错的tRNA，构象不会发生改变，结果反应过程变得很慢，这样增加tRNA在负载前从酶中解离出来的机会。这种控制的类型称为动力学校对（kineticproofreading）。在氨基酰tRNA合成酶中，氨基酸的特异性通过逆反应进行校对称为化学校对（chemicalproofreading）。在校对一个错误氨基酸时有两个阶段可以进行。一个是校对错误的氨基酰-腺苷。另一个是校对错误的氨基酰-tRNA。两个步骤都需要正确的tRNA存在。Ile-tRNA合成酶活化位点水解位点二、蛋白质的合成蛋白质合成分为三步：起始(Initiation)：包括蛋白质起始的两个氨基酸之间形成肽键之前的反应。这需要核糖体与mRNA结合，形成起始复合物，其中含有第一个氨酰-tRNA。这一步反应速度在蛋白质合成中是相对较慢的，通常是翻译的限速步骤。延伸(Elongation)：包括从第一个肽键形成到最后一个氨基酸掺入过程中所有的反应。氨基酸的掺入非常迅速，是蛋白质合成中最快的步骤。终止(Termination)：包括释放完整的多肽链及核糖体与mRNA分离。每一步都需要不同的辅助因子参与，能量由GTP水解提供。核糖体的作用位点A位点(或称acceptorsite):可以进入氨基酰-tRNA(aminoacyl-tRNA)。P位点(或称供位，donorsite):

是被肽基酰-tRNA(peptidyl-tRNA)所占据。E位点(Exitsite):脱酰tRNA(deacylated-tRNA)短暂地占据。（一）翻译的起始

I在细菌中翻译的起始IF-3是30S亚基与mRNA起始位点的特异结合所必须的。IF-2是特异地和起始子tRNA结合并把它带到核糖体中。其还具有核糖体依赖的GTP酶活性。IF-1仅作为完整的起始复合物的一部分,与30S亚基A位点结合，阻止氨酰-tRNA的进入，它的占位还可阻止30S亚基与50S亚基的结合。起始tRNA所有蛋白质的起始氨基酸都相同为甲硫氨酸。肽链合成起始的信号是一个专一的起始密码子(InitiationCodon)，这个密码子也标志着读码框的起始。通常情况下，起始密码子为AUG，但在细菌中也可能是GUG和UUG。AUG编码甲硫氨酸，有两种tRNA可携带这种氨基酸。一种用于起始，另一种用于延伸。在细菌和真核生物细胞器(如线粒体)中，tRNA起始子携带的甲硫氨酸残基在氨基端被甲酰化，成为氨甲酰甲硫氨酸tRNA。这种tRNA写作tRNAfMet。这种氨酰-tRNA的名字通常被缩写为fMet-tRNAf。它识别的密码子为AUG或GUG(偶尔也识别UUG)。这些密码子被识别的程度不同，若将AUG替换为GUG，则起始的效率将会降低大约一半，若替换为UUG，则效率将会在这个基础上又降低大约一半。fMet-tRNAf与Met-tRNAm有什么不同fMet-tRNAf与Met-tRNAm有什么不同甲酰化并不是必不可少的，因为没有甲酰化的Met-tRNAf

也能行使起始子的功能，但甲酰化能提高Met-tRNAf与IF-2结合的效率。除了tRNAfMet

以外，所有tRNA氨基酸臂末端的几对碱基都是配对的。如果在此位置突变使之配对，则该Met－tRNAf也将能参与延伸。因此，此位置的不配对碱基阻止该tRNA参与延伸，并且，这种不配对也是甲酰化所需的。tRNAfMet在反密码子环的茎上有3对G-C,若发生突变将会阻止其进入P位点。起始密码子的识别一个mRNA分子中含有许多AUG密码子，那么，起始密码子是怎样被识别并被作为翻译起始位点的呢？在细菌中被核糖体保护的起始序列长~30个碱基。不同的细菌mRNA中的核糖体结合位点都有相同的特点：AUG(或偶尔GUG或UUG)起始密码子总是位于被保护的序列中。在AUG上游10个碱基以内有一段序列接近或同下面的序列完全相同：5′…AGGAGGU…3′这段多嘌呤的序列被称为SD(Shine-Dalgarno)序列。它与16SrRNA上靠近3′一段保守序列配对。以反方向写出rRNA中的这段序列如下：3′…UCCUCCA…5′在细菌和线粒体中，甲酰化的残基是由一种专一的去甲酰化酶(Deformylase)催化去掉的，这种反应会产生普通的氨基端。如果蛋白质氨基端最终氨基酸是甲硫氨酸，则只需要这一步反应。在大约一半的蛋白质中，末端的甲硫氨酸被一种称为氨肽酶(Aminopeptidase)的酶去掉，产生一个携带R2的新的N端。如果这两个反应都需要，则按顺序进行。去除反应发生很快，很可能在新生肽链达到15个氨基酸长度时完成。真核生物中没有与SD序列配对的五个基本碱基CCUCC。真核生物中，mRNA和18SrRNA似乎没有配对。这是真核与原核生物起始机制很重要的不同之处。在体外实验中，将mRNA的帽子去掉后，发现翻译效率降低。这暗示着什么？有时AUG起始密码子位于mRNA5´末端40个碱基以内，使帽结构和AUG都位于核糖体结合的范围之内。但在很多mRNA中帽结构和AUG之间的距离要远的多，最远可达到~1000个碱基。然而，帽结构的存在对在起始密码子形成稳定的复合物是必要的。核糖体是怎样兼顾距离如此远的两个位点的呢？II真核生物蛋白质合成的起始“扫描”模型决定因素：在AUG前三个碱基位置上的嘌呤(A或G)和随后的G是最重要的。序列特点：NNNPuNNAUGG称为Kozak序列真核生物细胞质中的翻译起始需要AUG作为起始位点。起始tRNA是一种不同的类型，但其所带的甲硫氨酸没有被甲酰化。它称为tRNAiMet。所以起始与延伸中所用的Met-tRNA之间的区别只是在tRNA上有所不同，Met-tRNAi用于起始，Met-tRNAm用于延伸。在酵母中，起始tRNAiMet至少有两个独特的特点；它有一种特殊的三级结构，在64号碱基的2`核糖位置被磷酸化(如果不存在这一修饰则起始子可用于延伸)。可见在真核生物中用于起始和用于延伸的Met-tRNA不同的这一规律依然保存着，只是结构基础不同于细菌。真核生物蛋白质合成起始的辅助因子与Met-tRNAi组成复合体与5`端的mRNA组成起始复合体使mRNA－转录因子复合体与Met-tRNAi转录因子复合体结合确保核糖体从5`端扫描mRNA直到第一个AUG在起始位点探测tRNA起始子与AUG的结合介导60S亚基的加入只有当eIF2和eIF3被释放后，60S亚基才能与起始复合物结合。这个过程由eIF5调节，并引起eIF2水解GTP。该反应发生在核糖体小亚基内，并需要tRNA起始子与AUG起始密码子的配对。当80S核糖体形成后，几乎所有剩余的因子均被释放。释放的因子，可以与其他tRNA起始子及核糖体亚基结合以参与另一轮起始循环（这需要eIF2B帮助，用GTP置换GDP再生eIF2）。eIF2是调控的靶标。几种激酶能作用于eIF2的α亚基。磷酸化能阻止eIF2B再生出它的活性形式，这将eIF2B的作用限制在一次起始循环内，从而阻止了蛋白质的合成。对一些病毒(如脊髓灰质炎病毒)来说还存在着别的起始方式，在这些病毒的RNA内部存在着IRES(内部核糖体进入位点,internalribosomeentrysite)位点，根据它们与40S亚基的相互作用方式可分为：一种IRES序列包括AUG起始密码子，通过使用5`端起始相同的因子，40S亚基可以直接结合它。另一些则位于AUG上游大约100个碱基的位置，需要40S亚基的移动，同样以扫描的机制。一个特例是丙肝病毒的IRES。它可直接结合40S亚基而无需任何起始因子。（二）肽链合成的延伸延伸因子（elongationfactor）EF-Tu:与氨基酰tRNA及GTP结合当GTP存在时，EF-Tu呈活性状态。当GTP水解成GDP时，EF-Tu便失活。GDP被GTP取代后，它又恢复活性。EF-Ts:介导将使用过的EF-Tu-GDP转化为有活性的EF-Tu-GTPEF-G:结合核糖体和GTP这个三元复合物只能结合在P位点已被肽酰-tRNA占据的核糖体的A位点上。这个反应很严格，能保证氨酰-tRNA和肽酰-tRNA都处于正确的位置并形成肽键。每个细菌中有~70,000个分子的EF-Tu(占细菌蛋白质总量的5%)，这个数字接近氨酰-tRNA的分子数。这暗示大多数氨酰-tRNA都会参与三元复合物的形成。每个细胞中的EF-Ts的数量只有~10,000(大约同核糖体的数量相同)。对真核生物来说，eEF-1α负责携带氨酰-tRNA进入核糖体，这个反应同样涉及到GTP中高能键的裂解。它与它在原核生物中的对应蛋白质(EF-Tu)有同源性，而且，它也同样是一种大含量的蛋白质。当GTP被水解后，在因子eEF-1βγ的作用下又会变为活性形式，这个因子与EF-Ts对应。进位反应EF-Tu-GTP的水解相对较慢：因为这需要的时间比一个不正确掺入的氨酰-tRNA从A位点解离要长，很多不正确的氨酰-tRNA就是在这个步骤被矫正的。在水解后EF-Tu-GDP的释放也很慢，所以那些不正确掺入的氨酰-tRNA在这一步骤有可能解离下来。转位反应当多肽链从P位点的肽酰-tRNA上转移到A位点的aa-tRNA上时，核糖体仍保持在原来的mRNA位置上。负责肽链合成的活性被称为肽基转移酶(peptidyltransferase)。核糖体沿着mRNA向前推进一个密码子。易位导致脱酰-tRNA从P位点移出，进入E位点使新的肽酰-tRNA可以进入P位点，空着的A位点是为下一个密码子相应的氨基酰-tRNA的进入作好准备移位需要GTP和延伸因子EF-G易位反应EF-G与氨酰-tRNA-EF-Tu-GDP三元复合物竞争同一个结合位点。每种因子在离开核糖体后另一种因子才能结合，这种机制保证蛋白质合成有序的进行。引发易位作用，核糖体发生移动后它被释放。这是易位作用机制中的重要组成部分每个细胞中约有2000个分子，每个核糖体约有一个拷贝的EF-G在真核生物中与EF-G对应的是eEF-2，它的功能与依赖GTP水解的易位酶(Translocase)相似。梭链孢酸也能抑制它的作用。eEF-2-GTP复合物很稳定，并可被分离出来，复合物可以结合到核糖体上，并随后水解GTP。梭链孢酸黄色霉素（三）肽链合成的终止

3个终止密码子可结束蛋白质的合成。在细菌的基因中，UAA是最常用的终止密码，UGA又要比UAG重要。没有一个终止密码子具有相应的tRNA。它们的功能完全不同于其他的密码子，而是直接被蛋白质因子所识别。在E.coli中有两种相关蛋白催化终止，它们被称为释放因子(releasefactors，RF)，它们对不同的终止密码子是特异的。RF1识别UAA和UAG；RF2识别UGA和UAA。这两种因子作用于核糖体A位点且需要P位点的肽酰-tRNA存在。它们都需要第三个因子，RF3(II型)的帮助。释放因子的水平比起始因子及延伸因子低得多；每个细胞中有~600个分子，相当于每10个核糖体含有1个RF分子。I型RF1和RF2识别终止密码子并活化核糖体使之水解肽酰-tRNA。将多肽链从tRNA上剪切下来的反应与通常的肽酰转移反应类似，只是它的受体是H2O，而不是氨酰-tRNA。接下来RF1和RF2在RF3的作用下从核糖体上解离下来。RF3是一种GTP结合蛋白，同EF-Tu及EF-G的GTP结合结构域相似，RF1/2与EF-G的C末端相似，EF-G则与tRNA相似。这提示RF3与RF1/2的反应利用了延伸因子所用的位点。这三种因子拥有相似的形状并可结合在核糖体的同一个位点上(很可能是A位点或与其有重合的位点)。真核生物中，只有一种称为eRF1的I型释放因子，其能识别全