第五章分子生物学研究法(上)1

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术

第五章

扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。图1-1DNA是“转化源”二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。GeneralizedmodelofsemiconservativereplicationofDNA.Newsynthesisisshowninblue.三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。Crick于1958年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。中心法则的演变1958年首次提出的“中心法则”1970-1980年的“中心法则”21世纪后修正的“中心法则”上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。

图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端。WernerArber,HamiltonSmithandDanielNathanswereawardedthe1978NobelPrizefortheirworkonREs.图5-2DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体

PvuⅡRE切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n

来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096bp核DNA有一个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256bp核DNA就有一个酶切位点（44）。重组DNA实验中常见的主要工具酶酶类功能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3‘末端加上多聚或单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链末端的磷酸基团

（二）基因克隆的载体载体三要素：自我复制能力携带外源基因片段大小插入位点多少易于鉴定识别程度大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。AmpR优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积1000~3000个拷贝，便于制备重组体DNA。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。

图5-3重组DNA操作过程示意图

4、其它常见的质粒载体5.2DNA操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在生理条件下，DNA电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。表5-3琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。凝胶电泳中，加入适量溴化乙锭对核酸分子进行染色，紫外光下发荧光。每条DNA带中仅含0.05μg微量DNA，也可以被清晰地检测出来。加标准分子量DNAMarker,测定分子量加标准浓度的DNA，测定浓度图5-4DNA脉冲电场凝胶电泳示意图5.2.2细菌转化与目标DNA分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。细菌转化（transformation），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。图5-5细菌转化及蓝白斑筛选

为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（competentcells）。CaCl2法将快速生长期大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到5×106~2×107个转化子/µg超螺旋质粒DNA。

电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至4℃后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度菌液（~2×1010/ml）置于特制的电极杯中进行电击。获得最大转化效率时场强一般为12.5~15kV/cm，时间跨度一般为4.5~5.5毫秒。电击转化与温度有关，一般在0~4℃进行。由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。

5.2.3聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomicPCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。图5-7聚合酶链式反应（PCR）技术图5-8PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较1989年12月，著名的自然科学杂志“SCIENCE”将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。主编DanielKoshlandJr.写道：第一篇有关PCR的论文发表于1985年。自那以后，PCR已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。……有了PCR，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。PCR技术的原理首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸和实验中提供的引物序列合成新生的DNA互补链。

DNA解链（变性）引物与模板DNA相结合（退火）

DNA合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n,实得1.8n.将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。94℃加热，淬火降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。TherewasatimewhentoamplifyDNA,从前你要扩增DNA，

Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.总有培养大批细胞的重任要你背。

ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,这时有个家伙叫KaryMullis博士的，

Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.他钻出来说体外合成也一样OK！

Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，

Nucleotidesandpolymerases,too.还有核苷和聚合酶。

Denaturing,annealing,andextending.变性，退火，和延伸。

Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.加热~冷却~加热~太神奇了！

PCR,whenyouneedtodetectmutations.当你想要检测突变，来啊做PCR吧！

PCR,whenyouneedtorecombine.当你想要基因重组，来啊做PCR吧！

PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧！

PCR,whenyouneedtosolveacrime当你想要侦破大案，来啊做PCR吧！5.2.4实时定量PCR（realtimequantitativePCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成DNA片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非序列特异性荧光染料SYBRGreenI,激发光波长520nm。SYBRGreenI作探针的实时定量PCR实验过程图示用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量A扩增曲线循环数荧光强度Log值循环数B标准曲线Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。

为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。TaqMan探针是