第6章基因操作中大分子的分离和2013

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第8周周3第7节N1-121第六章

基因操作中大分子的分离和分析第一节DNA的分离、检测和纯化第二节RNA的分离、检测和纯化第三节分子杂交第四节RNA作图和端点分析第五节重组DNA分子导入大肠杆菌第一节DNA的分离、检测和纯化一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化二、DNA的琼脂糖凝胶电泳三、聚丙烯酰胺凝胶电泳四、脉冲场凝胶电泳五、DNA片段的纯化一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化依据是利用分子大小不同和质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前最常用的是碱裂解法。1碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理◆碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。◆在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。◆当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。◆通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。大肠杆菌质粒DNA的提取步骤碱抽提法所用试剂的生化作用

提取过程中所用的材料有LB培养基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris•HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE缓冲液、3mol/L乙酸钾溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、异丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用,同时有利于溶菌酶的作用。

②NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R-O-S03-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。③KAc:

pH4.8的KAc溶液是为了把pHl2.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。高盐3mol/LKAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式复合物，使沉淀更完全。

④无水乙醇:沉淀DNA，它的优点是可以任意比例和水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。

⑤酚-氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。⑥异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

152通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA

二、DNA的琼脂糖凝胶电泳1、凝胶电泳的基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越快，反之则较慢。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。2、影响电泳迁移速率的因素：1）分子筛效应DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。

2）相对分子质量具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。

3）构型质粒DNA超螺旋(SC)、开环状(OC)、线状(L)

3种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。3、DNA的琼脂糖凝胶电泳1）DNA的显示原理：制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭(EB)在紫外光照射下能发射桔红色的荧光。荧光的强度正比于DNA的含量。若用薄层分析扫描仪检测，只需要5～lOngDNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1μg的DNA。EB染色原理

当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。

琼脂糖含（%）DNA片段的有效分离范围(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程A、缓冲液制备B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存C、将点样梳洗净干燥放入胶板中D、琼脂糖胶板的制备：称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，按所需凝胶浓度加入适量体积的缓冲液，将三角瓶塞口，微波炉中融化。

融化好后冷却到60℃左右，加入EB溶液，至最终浓度为0.5ug/ml。摇匀倒入放置好点样梳的胶板中，排走气泡。室温放置30-45min。2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程E、加样和电泳：将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，排出加样孔内的气泡，用微量移液枪加入DNA样品。接通电源，调好电压和电泳时间。可根据溴酚兰的位置结束电泳，关闭电源。F、取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机焦距拍照2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程2）琼脂糖凝胶电泳的操作过程紫外线光源灵敏度:302nm>254nm>366nm常用的Marker三、聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：分辨率高适于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp载样量大回收DNA纯度高PAGE装置电泳PAGE应用范围分离、纯化和鉴定RNA和小分子DNA

DNA序列分析

PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析四、脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)采用定时改变电场方向的交变电源，每次电流方向改变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向，反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。专门针对大片段DNA的分析检测方法。+++-----2五、DNA片段的纯化DNA经过酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分析在凝胶上会呈现DNA条带，从中分离特定大小的DNA片段可用于进一步深入的研究。常用的DNA纯化方法有：低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、“基因纯”试剂纯化等。低熔点琼脂糖凝胶电泳法首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在几分钟之内即可以高效回收核酸片段。1）切胶，放入1.5ml离心管中；2）加入溶胶液，置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化；3）琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体；4）在吸附柱中加入漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体；5）重复漂洗一次；6）12000rpm室温空离心1分钟；7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心1分钟；8）琼脂糖凝胶电泳检测回收产物；凝胶纯化结果示意图透析袋电洗脱法适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。步骤：电泳分带。切胶，装入透析袋，进行电泳1-2h后，再反向电泳1-2min。洗脱液离心。转移，加入2倍体积无水乙醇混匀，于-20℃放置过夜沉淀后，离心后去除上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。

通过凝胶电泳回收的DNA样品，因检测需要而含有溴化乙锭(EB)，会影响限制性核酸内切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或异戊醇)抽提或Dowex(道埃克斯)树脂层析法等。DNA的浓缩

当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时，必须进行DNA溶液的浓缩。实验室常用的方法有：

乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等。

乙醇沉淀

DNA不溶于乙醇，因此可用乙醇来沉淀DNA以达到纯化DNA的目的。乙醇沉淀是浓缩DNA的常用方法。1、按DNA溶液量的1/10体积加入3mmol/LNaAc。2、加2.5倍体积的预冷100%乙醇，盖上盖子混匀。3、-70℃静置15min，或-20℃静置1h以上。4、4℃、15000r/min，离心15min，沉淀DNA。5、弃上清。6、加70%乙醇适量，漂洗沉淀，再次离心。7、干燥10~30min。8、加TE溶解。盐能中和核酸上的电荷，因此易使DNA沉淀，但加入过多易产生盐析。（四）DNA的定量和纯度测定

DNA样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、EB荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。

紫外光谱分析法

紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值表示，OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。当OD260/OD280小于1.8时则有蛋白质污染。双链DNA的OD260为1时相当于浓度为50μg/mL。单链DNA的OD260为1时相当于浓度为40μg/mL。寡核酸的OD260为1时相当于浓度为20-40μg/mL。EB荧光分析法由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，则荧光强度可以表示DNA量的多少。EB是嫌疑性的致突变物质。第二节RNA的分离、检测和纯化细胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。－80%～85%rRNA(28S、18S、5SrRNA)。－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核内小分子RNA等）。

－1%～5%mRNA，一般按2%计算。Trizol法提取细胞总RNARNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。常用的RNA酶抑制剂：焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用）异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。

2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1%DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RNase的Ep管、Tip头。3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。注意事项4.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗5.配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度0.1%处理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌）6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。酸性苯酚促使RNA进入水相，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。水相加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。Trizol法提取原理真核生物mRNA的纯化（1）寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA（2）磁性分离技术纯化mRNA（1）寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA磁性分离技术纯化mRNA先将连有生物素的oligo(dT)引物与mRNA3’-端的polyA一起杂交；加入连有生物素结合蛋白的磁球，使杂交体与磁球结合；通过磁场作用，使连有杂交体的磁球与其他RNA分离；通过洗脱将连在磁球上的mRNA洗脱下来而得到纯化的mRNA。该方法简单、迅速、不易引起mRNA的降解。RNA的电泳检测RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断，OD260为1时相当于浓度为40μg/mL。检测：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法。28S18S总RNA电泳条带第三节分子杂交

一、Southern杂交二、Northern杂交三、菌落原位杂交四、Western杂交分子杂交

(moleculehybridization)分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子，以及其相对分子量大小。根据其检测对象的不同可分为

Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，及由此简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行，也可能在蛋白质与蛋白质之间进行。核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变性以后，在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

一、Southern杂交

这种方法是E.M.Southern1975年建立,是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。（一）Southern杂交的操作步骤1.预处理：

（1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。（2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。（3）凝胶泡在强碱溶液中，双链的DNA样品变性。（4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态2.原位转移：将凝胶上的单链DNA转移到尼龙膜上。3.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。将核酸样品进一步固定在滤膜上4.杂交：杂交之前须有一个预杂交，封阻膜的背景，避免杂交时背景吸附探针。封闭试剂成分主要是大量的非同源性的核酸或蛋白质等。将滤膜移入含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，滤膜上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。

5.漂洗：将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来。6.放射自显影：在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。7.比较鉴定：将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA2.通过毛细管渗析法转移胶中的DNA3.固定胶中的DNA4.预杂交和杂交(放射性和荧光检测)5.结果检测，比较鉴定。（一）Southern杂交的操作步骤Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏。在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。

1.硝酸纤维素滤膜

在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处:

（1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固。（二）Southern杂交的杂交滤膜（2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂。（3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度。（4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。2.尼龙膜优点：结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。缺点：杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。

将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。二、Northern杂交Northern杂交的过程①提取总RNA。②分离mRNA。利用亲和层析的原理纯化mRNA。③制备RNA探针。根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。④Northern杂交。Northern杂交的方法包括点杂交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰度。三菌落原位杂交

（colonyinsituhybridization）直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落。菌落原位杂交的操作步骤

四Western杂交是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度（50ng）。原理：先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中经SDS电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体）最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentWestern杂交的操作步骤

总结◆

Southern印迹法（DNA印迹法,Southernblotting）：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。◆

Northern印迹法（RNA印迹法,Northernblotting）：Alwine等人将Southern印迹法应用于RNA，原理与Southern印迹法相似。◆

Western印迹法（蛋白质印迹法，Westernblotting）：是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。◆

Eastern印迹法（Easternblotting）：也是一种蛋白质印迹法，与Western印迹法不同之处是：先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF）分离蛋白质，然后也是将蛋白质的分离区带、以电驱动转移方式进行了印迹。一、RNA的S1核酸酶作图：分析原mRNA加工剪接为成熟mRNA中的剪切区段和边界。二、S1核酸酶作图分析mRNA端点：5’和3’端均可分析。三、引物延伸法分析mRNA的端点：只能用于5’末端的作图。第四节RNA作图和端点分析(自学)RNA的S1核酸酶作图分析mRNA端点引物延伸法分析mRNA的端点第五节重组DNA分子导入受体细胞一

选择受体细胞的基本原则二

重组质粒DNA转化大肠杆菌基本概念●

受体细胞(receptorcell)

又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)等，能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。

●

感受态(competence)

细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。●感受态细胞(competentcell)

处于能够吸收DNA状态的细胞。●

细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。●转化子(transformant)：经转化获得外源遗传物质的细胞。●

转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。●

转染(transfecti