感受态细胞的制备及大肠埃希菌转化

感受态细胞的制备及大肠埃希菌的转化中南大学生命科学学院实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

转化特指在基因克隆技术中将质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

载体是基因克隆中的重要运载工具，它们是通过改造天然质粒、噬菌体和病毒等构建的，其中质粒是分子克隆中最常用的载体之一。

质粒是独立于细菌染色体之外的一种双链闭合环状的DNA分子，能利用细菌染色体DNA复制、转录的同一套酶系统，在细菌体内独立地进行复制及转录。实验原理细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀形成球形，DNA形成不易被DNase降解的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经42℃短时间热冲击处理（热休克），细胞可以吸收附于细胞表面的DNA复合物。然后在不含抗生素的培养基中培养一段时间，球状细胞得到复原并分裂增殖，其中被质粒转化的细菌中，质粒DNA得到复制，抗生素抗性基因得到表达，随后，将培养物接种在含有抗生素的琼脂平板上，只有被转化了的细菌才能在平板上生长，经过12~16小时培养，可生成肉眼可见的菌落。实验原理实验原理

分子量相对较小，3-10kb，能在细菌中稳定存在，有较高的拷贝数--松驰型质粒。具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择。如抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因等。具有多个限制性核酸内切酶的单一切点--MCS。便于外源基因的插入。质粒载体的特点实验原理对载体的复制和扩增没有严格的限制。不存在特异的内切酶体系降解载体DNA。在载体增殖过程中，不对载体DNA进行修饰。

不产生载体DNA的体内重组。

易导入重组DNA分子。适当的宿主细胞具备特点:实验原理原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌等，常用的为大肠杆菌。真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等。宿主细胞外源DNA没有明显的遗传标志，若直接导入宿主细胞，无有效方法区分导入和未导入外源DNA的细胞。外源DNA导入宿主细胞后，能否在细胞中进行复制并长期保存及其分离纯化是问题，因此，必须有一个能在该宿主细胞中进行自我重制和表达的载体来携带外源DNA。实验原理为何要将外源DNA与载体连接后，再导入宿主细胞？实验步骤一、感受态细胞的制备（从第4步开始）1.从菌种保存管中挑取一环细菌（大肠杆菌DH5α），接种于不含抗生素（Amp）的琼脂平板上，37℃培养过夜（12~16h）。2.挑取单个克隆转入10mlLB液体培养基中（不含Amp），37℃200转/分培养过夜（12~16h）。3.将10ml过夜培养物转入200mlLB液体培养基中（不含Amp），37℃200转/分培养4h左右，使其OD600值为0.4~0.6（约为5×107细胞/ml），于冰上冷却至0℃。4.取1.5ml培养物置于1.5mlEP管中，5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀。5.以700μl冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液（0.22μm滤器过滤）重悬细菌，冰浴30min。6.5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀。7.将细胞重悬于100μl冰预冷的含10%甘油的0.1mol/LCaCl2溶液中，-80℃冻存备用。实验步骤二、转化1.将制备的感受态细胞置于冰上，使其自然解冻。5μl质粒DNA（约50ng）加入1管感受态细胞中，轻轻混匀。2．致敏：冰浴20min。3．热休克：42℃水浴中45－90s，冰浴2min。4．铺板混合物制备：向上述管内加入500μl无抗生素LB液体培养基，37℃200rpm水平匀速振荡培养40－60分钟。5．铺板：将玻棒弯制的三角推子在酒精灯上充分烧灼（2－3分钟，然后充分冷却3－5分钟）；将培养的铺板混合物颠倒重悬，取100μl置平板中央，用冷却的推子均匀涂布在含抗生素的固体LB培养基上。6．室温放置10分钟，倒置，37℃恒温培养过夜。7．次日下午，挑取单个菌落（单克隆菌落）转入液体培养，可用于保种、质粒DNA提取及其他操作。结果分析极少或无菌落假阳性克隆卫星菌落影响转化效率的因素

1.感受态细菌的基因型：Crp-（能特异影响转化效率的基因）基因型的转化效率要比Crp+基因型的感受态高出很多。2.菌株的生长条件：从-70℃冰箱中细菌保种管中取出的细菌直接划平板，再转至液体培养基中培养所制备的感受态转化效率最高。致敏前，应收获对数期或对数生长前期的细菌进行感受态的制备（OD600值为0.3~0.4）。3.玻璃和塑料器皿的清洁度：痕量去污剂或其它化学物质的存在可能大大地降低细菌的转化效率，因此，所用的物品均必须清洗干净并进行高压灭菌。影响转化效率的因素

4.转化缓冲液：⑴试剂的纯度：尤其是CaCl2，务必使用能够得到的最高质量的试剂（以进口试剂为最佳），分装成小份，4℃避光保存。⑵pH值：pH>8或pH<4时，得不到任何转化子，pH4~8时，转化效率呈钟形曲线，峰值约为6.4~6.8，中性或偏弱酸性。⑶阳离子：二价阳离子，常见：Mg2＋、Mn2+、Ca2+、Zn2+、Co2+等Mg2＋、Mn2+、Ca2+：低浓度时十分有效⑷冻存保护剂：10%甘油。使细胞在冻存过程中防止冰晶的形成而损伤细胞活性，但甘油可使转化效率降低约30%。5~7%DMSO。能使转化效率提高，但需在液N2中保存。5．转化步骤DNA量、冰浴时间、热冲击时间、复苏时间6．质粒分子量大小：4~7.3kb，转化效率基本一致。7．其它因素：玻璃管、LB培养基、体系中的T4DNA连接酶8．注意操作，防止杂菌污染。问题及解决方法

极少或无菌落⑴感受态细胞失活：感受态细胞只能在-70℃保存数月，转化效率随保存时间延长而下降。可重新制备感受态细胞。⑵DNA量：过少或过多，均可导致转化效率的下降。⑶DNA体积：过大，不能超过感受态细胞总体积的10%。⑷DNA片段连接不成功：①T4DNA连接酶及反应缓冲液失活：少量分装后，-20℃保存。因为反复多次冻融或贮存于4℃会导致反应缓冲液中的ATP降解；②载体末端与插入片段末端之间难以连接；③使用了错误的限制性核酸内切酶，或在设计引物时限制性核酸内切酶的序列方向写反，导致酶切不成功。⑸抗生素：使用错误的抗生素，或抗生素的浓度过高。问题及解决方法

假阳性克隆⑴以单酶切的载体，去磷酸化不够，载体自身环化效率过高。⑵琼脂平板上的抗生素失活或含量过低：可直接将无DNA转化的感受态细胞铺于平板上，看是否有菌落生长。若有，则表示抗生素失活或含量过低。⑶载体DNA与插入片段的分子比率过高，导致载体自身环化机率增高：减少载体量，最佳比例为2~3﹕1。问题及解决方法

卫星菌落

指在正常大小的阳性菌落周围有一些很小的菌落克隆，这些小的克隆称为卫星菌落。这些卫星菌落是Amp敏感的，通常不包含质粒。⑴转化细胞铺板的密度：用转化细胞铺板时，密度较不能太高，每个90mm平板不超过104菌落。铺平板时密度太高也可导致卫星菌落的产生。⑵培养时间：37℃培养的时间为12-16h，不应超过20h。培养时间过长，氨苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素，从而导致卫星菌落的生长。几种转化方法的比较

CaCl2方法：能达到5×106~2×108转化子/μg超螺旋质粒DNA，可以满足一般的基因克隆需要。方法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，但贮存时间过长将导致转化效率的下降。CaCl2/RbCl方法：对某些菌株的转化高于标准的CaCl2转化方法。CaCl2/MnCl2方法：多数可达到5×107~1×108。MgCl2方法：联合PEG和DMSO，转化率可达到107~108，适用菌株广泛，-70℃保存4个月后，转化效率无明显下降。一步操作即可制备感受态，短暂，转化过程中不需热休克。DNA用量小(1ng)。高电压脉冲电击法：操作简单，109~1010转化率，对任何菌株均适用。电压高，脉冲时间长，则转化率越高，但细胞死亡率也增高。重组子的筛选与鉴定初筛：1.抗生素平板：只有转化了质粒的大肠杆菌才具有抗生素抗性，才能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。2.蓝-白筛选：α-互补进一步鉴定：1.提取质粒后，酶切鉴定------可用于鉴定大小及插入方向。2.SouthernBlot------用标记的相应外源DNA片段作为探针，与印迹在膜上的DNA杂交，鉴定是否含有靶