从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案

1土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性试验方案一、综述：的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布格外广泛，是人们常常争论的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。二、试验目的要求了解生物分别提纯的原理和方法技术把握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法把握微生物摇瓶培育方法及淀粉酶活力测定的原理和方法培育学生的综合应用微生物试验方法的力气培育学生自行设计试验流程、综合分析问题解决问题和推断试验结果的力气。三、试验原理【2】、分散芽孢【3】。由于芽孢杆菌属二、试验目的要求了解生物分别提纯的原理和方法技术把握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法把握微生物摇瓶培育方法及淀粉酶活力测定的原理和方法培育学生的综合应用微生物试验方法的力气培育学生自行设计试验流程、综合分析问题解决问题和推断试验结果的力气。三、试验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进展生长生殖和生命活动中所需的各种条件。土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤外表，由于日光照耀及枯燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量削减【5】。值得指出的是，从微生物群体中经分别生长在平板上的单个菌落并不愿定保证是纯培定，有些微生物的纯培育要经过一系列分别与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP值得指出的是，从微生物群体中经分别生长在平板上的单个菌落并不愿定保证是纯培定，有些微生物的纯培育要经过一系列分别与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；养分体的最高生长温25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl25%NaCl；养清楚胶〔22℃〕71厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代个氨态盐作为唯一的碳源和氮源【6】。细菌特性生殖快速:106倍。生命力强:无湿状态可耐低温-60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧生殖)、耐低氧(厌氧生殖)。体积大:体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长生殖。四、试验材料和用具4.14.1土样采集：采集宽阔植物园内的有机土壤，和生化楼下花坛的有机土壤养分琼脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5～2.0 蒸馏水15%2mLpH7.2～7.4。参与琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。淀粉牛肉膏蛋白胨培育基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5～2.0 校正pH至7.2～7.4发酵培育基(%)：玉米粉2 黄豆饼粉1.5 CaCl0.02 MgSO40.02 NaCl0.25K2HPO40.2 柠檬酸钠0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.0葡萄糖蛋白胨培育V.P试验用〔葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO40.2pH7.2～7.4蛋白胨水培育〔吲哚试验用〔蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH7.～7.4西蒙氏柠檬酸盐培育基〔%〕：氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂校正pH6.8先将盐类溶解于水中，校正pH，再参与琼脂，加热溶化，然后参与指示剂，混匀后分装试管，12115min。配制养清楚胶培育基〔%〕：蛋白胨0.50.31.2，调pH6.8~7.0耐盐培育基〔%〕：10.321.5～2.0蒸馏水10.3101.5～2.0蒸馏水10.3201.5～2.0蒸馏水10.3251.5～2.0蒸馏水15%2mL，校正pH7.2～7.4。参与琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。溶液或试剂染料革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀绿溶液,石炭酸复红液;香柏油、二甲苯吲哚试验：乙醚、吲哚试剂V.P.试验：40％NaOH溶液、α-奈酚，淀粉酶活力测定：1%3,5-二硝基水杨酸试剂仪器或其它用具无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环无菌培育皿 土样 三角瓶烧杯 洗瓶玻棒试管酒精灯擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。恒温摇床恒温培育箱高压蒸汽灭菌箱超净工作台水浴箱紫外灯照耀箱磁力搅拌器玻1、初筛方法①制菌悬液5g45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为10-1124组，编AB。②加热筛选有芽孢的菌：将2个锥形瓶加塞、包扎、摇匀〔无菌室里〕，利用恒温水浴装置100℃左右水浴，水浴锅温度恒定后维持15min〔制悬液时就应先开头加热〕，制成10-1g/ml的土壤悬液③梯度稀释菌悬液：9mL5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液参与10-210-2土壤10-21mL10-3的无菌水试管中，混匀后即10-310-4、10-5土壤稀释液。在土壤稀释过程中，用一样的移液枪头由浓到稀来稀释。④涂布平板用一支的无菌枪头，由低浓度开头，从各浓度土壤稀释液中各100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培育基平板3个平板〔重复〕。3724h。2、复筛方法【1】划线接种〔分区划线法〕：在上述不同稀释度培育基中挑取不同形态的单菌落进展分区划线先在平板培育基的一边作第1次平行划线3~4条，60122次平行划线局部作第334〔如右图。划28~29°C20h.。再连续分区2-3次，以获得较纯的菌种。将纯化得到的单菌落分为两局部，其中一局部接种到培育基内，用以保存菌种，另一局部用来做染色试验。3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种：上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不全都的点接于倒好的淀粉牛肉膏培育基8537℃24h。上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培育基平板于试验室，其他置37℃下培育24h斜面接种。34革兰氏染色步骤：涂片、枯燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。媒染：先用配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其掩盖涂面1分钟，后水洗。95%酒精进展脱色约15－20秒，后马上用流水冲洗。3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。镜检：油镜观看染色结果。芽孢染色染色镜检：·3718～24h的枯草芽孢杆菌涂片，枯燥，固定。·3～55%孔雀绿水溶液。·4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。·倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。·用石炭酸复红液复染lmin，水洗。·制片枯燥后用油镜观看。芽孢呈绿色，菌体红色。〔注：观看芽孢的外形和位置，查伯杰细菌手册〕斜面保存菌种·贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管2～3cm〔3管，标上一样编号也要与平板上菌落编号相对应〕。进展斜面接种操作，加塞、包扎好到37℃培育箱里培育24h。5、菌种的鉴定所得的斜面菌种接种到的平板上培育以观看筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿状况、形态、高度、透亮程度、边缘、是否易被挑起、气味等。然后进展一系〔具体步骤同上观看是否符合附表中芽孢杆菌的指标生理生化试验温度对菌种培育的影响；淀粉水解试验；温度对菌种的影响；明胶液化试验；糖发酵试验；乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)；吲哚试验；耐盐性试验；柠檬酸盐利用试验。·温度对微生物生长的影响将牛肉膏蛋白胨培育基熔化倒平板。〔培育基厚度为一般培育基的1.52倍〕30套牛肉膏蛋白胨平板，分别进展标号。在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。各取每个菌种两套平板倒置于4℃〔冰箱〕、37℃〔或者室温〕，60℃下24小时，观看细菌的生长状况。〔“—”不生长，“+”生长较差，“++”生长一般，“+++”生长良好。·淀粉水解试验以18-24h的纯培育物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板〔“字接种，〕或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培育24-48h，或于20℃培育5天。然后将碘性反响〔淀粉被分解〕为琼脂培育基呈深蓝色、菌落或培育物四周消灭无色透亮环、或肉汤结果与菌种产生淀粉酶的力气、培育时间，培育基含有淀粉量和pH等均有确定关系。培育基pHpH7.2为妥。·糖类发酵试验〔葡萄糖、木糖和乳糖发酵〕用小砂轮轻轻切割发酵管没有标签和标识的另外一端，留意保存标签和糖的名称。用接相对应。两种发酵管各设一支不接种，作为空白比照。留意接种的整个过程中，不能人为的作废应重做一管。接种后，每一管外包一层无菌纸，以防污染。接种完毕后，将全部发酵管倒置于干净小烧杯内，3724h。观看记录：与比照管比较，假设接种培育液保持原有颜色，其反响结果为阴性，说明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培育液呈黄色，反响结果为阳性，说明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培育液中的杜氏小管内有气泡为阳性反响，说明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反响，记录用“－”。·乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)标记试管：取装有葡萄糖蛋白胨培育液的试管，编号。接种培育37℃恒温箱中，24h。观看记录取出以上试管，充分振荡2min。每管分别参与40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，假设培育液呈红色，记录为V.P.试验阳性反响〔用“＋”表示〕；假设不呈红色，记录为V.P.试验阴性反响〔用“－”表示〕。·吲哚试验试管标记取装有蛋白胨水培育液的试管，编号。接种培育以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，空白比照管不接种，置37℃恒温箱中24h。观看记录在培育液中参与乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培育液的上面，此时沿管壁缓慢参与5～10滴吲哚试剂〔防破坏乙醚层影响结果观看〕性反响，否则为阴性反响，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。·耐盐性试验将分别获得的细菌分别接种在NaCl浓度为2%，10%，20%，25%，的牛肉膏蛋白胨液体培育基中,37℃下培育,[7]。·柠檬酸盐试验取装有西蒙斯氏柠檬酸盐培育基的试管分别标记待测菌种的编号和空白比照以无菌操作分别将少量菌苔接种于各支相应的管中，然后置于37℃恒温箱中培育24h。观看结果，假设培育基变蓝色，则说明该菌能利用柠檬酸盐作为碳源而生长，即为阳性反响，以“＋”表示。假设培育基仍为绿色则为阴性反响，以“－”表示【8】。6、产淀粉酶芽孢杆菌产淀粉酶活性的测定发酵：将初筛纯菌种接种于30/250mL种子培育基,37℃、250r/min摇床培育过夜。离心10min,取上清液测酶活,每个样品重复3次,最终结果取平均值。热10min，然后加适当稀释的酶液0.5ml，反响5min后，用5ml0.1mol/LH2SO4终止反响。取0.5ml反响液与5ml碘液显色，在620nm处测光密度。以0.5ml水代替0.5ml反响液为空白，以不加酶液〔加同样体积的缓冲液〕的管为比照。酶活力依据下式计算：酶活力〔u/ml〕=(R-r)/R*50*D式中R、r分别表示比照和反响液的光密度，D为酶的稀释倍数。调整D使〔R-r〕/R在0.2-0.7之间。确定在40℃5min内水解1mg淀粉的酶量为一个活力单位。菌种保藏法〔斜面冰箱包保藏法〕将菌种接种在颖外面培育基上，定温培育长出饱满菌苔后〔一般形成芽孢的细菌要形成芽孢〕，贴上标签，放在试管上，在棉塞部位用尼龙纸或防水纸包好，以防