质粒DNA的小量快速提取

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茫茫人海你我相遇就是缘分，欢迎下载！质粒DNA的小量快速提取22021/4/26

质粒DNA提取是基因克隆中的常规工作，他包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒DNA的抽提过程。32021/4/26实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。42021/4/26实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱裂解法基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。52021/4/26

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。62021/4/26质粒检测琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。72021/4/26质粒DNA的提取方法1.碱裂解法2.煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中,涡旋混匀。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),涡旋振荡3秒钟。5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8、取20ml进行电泳检查。82021/4/263.酚氯仿裂解法①从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30μg/mL）摇菌12h；收集1.5mL菌液，8000g/min离心3min，弃上清，沉淀加入200μLTE，充分混匀；加入400μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10s，混匀；12000g/min离心5min，1mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10s，12000g/min离心5min；沉淀溶于20μL的RTE溶液中，37℃水浴.②按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1h）.酶切产物10μL，10g/L琼脂糖凝胶电泳.③PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714bp.④常规制备感受态菌E.coliDH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15h后观察筛选克隆情况.92021/4/264.碱变性法5.SDS法6.羟基磷灰石层析法102021/4/261.器材

高压灭菌器，恒温摇床，高速离心机，微量可调式移液器，

1.5mL离心管等。2.试剂1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，去离子水950mL，待溶质完全溶解后，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1000mL，121℃，1.01×105Pa高压下蒸气灭菌20分钟。2.氨苄西林：100mg/mL

实验试剂和器材112021/4/269、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2月-232月-23Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。17:02:3117:02:3117:022/3/20235:02:31PM11、人总是珍惜为得到。2月-2317:02:3117:02Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。17:02:3117:02:3117:02Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2月-232月-2317:02:3117:02:31February3,202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20235:02:31下午17:02:312月-2315、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。二月235:02下午2月-2317:02February3,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023/2/317:02:3117:02:3103February202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。5:02:31下午5:02下午17:02:312月-23

3.溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L

Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L

EDTA(pH8.0）。配制方法：1M

Tris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5M

EDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min，贮存于4℃。4.溶液Ⅱ（新鲜配置）：0.2MNaOH，1%

SDS。配制方法：2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。5.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。配制方法：5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。132021/4/26

6.酚/氯仿：将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH7.6，至棕色瓶中4℃。

7.TE缓冲液pH(8.0)：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。8.RNaseA(10mg/mL)9.70%乙醇,无水乙醇。142021/4/26实验步骤1.细菌培养将含有pQE30质粒的大肠埃希菌TG1接种到10mL含有氨苄西林（100μg/mL）的LB培养液中，37℃振摇过夜。2.收集菌体取1.5ml菌液转入离心管中，10000r/min离心1min，弃上清。3.悬浮细菌将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡使细菌沉淀悬浮。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则提取DNA的纯度和得率会大大降低。（溶液I的作用是分散细胞，并螯合金属离子使能够破坏质粒DNA的DNase失活。152021/4/264.碱液裂解加入新配制的溶液Ⅱ200μl，轻缓颠倒离心管6-8次，使管内容物混均，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2min。（溶液Ⅱ的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱性条件下变性。）

5.中和与复性加入150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻缓颠倒数次，使溶液III在粘稠的菌液裂解物中分散均匀，在冰浴中放置5min。（溶液Ⅲ的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA和蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。）6.离心沉淀用台式高速离心机12000r/min离心5min,将含有质粒DNA的上清转入另一离心管中。7.酚/氯仿抽提除蛋白加入等体积的酚-氯仿，剧烈振荡混匀,静置3min待其分层后，12000r/min离心10min，将上层液转入另一离心管中。162021/4/268.乙醇沉淀质粒DNA加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，静置5min使质粒DNA形成沉淀。12000r/min离心10min，收集质粒DNA沉淀，弃上清液。9.乙醇洗盐质粒DNA沉淀里含有一定量的盐分需出去。加入1ml70％乙醇，轻缓摇动数次，12000r/min离心2min。弃上清液。10.溶解质粒DNA待残存乙醇挥发干净后，加30μlTE缓冲液(pH8.0）溶解沉淀，加2μlRnaseA（10mg/L)，37℃保温30min以去除RNA。所得质粒DNA置-20℃保存备用。172021/4/26注意事项1.提取过程应尽量保持低温。2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。182021/4/26思考题1.溶液I,II,III的作用分别是什么？加溶液I,II,III使要注意哪些问题？2.实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分别是什么？192021/4/269、人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2月-232月-23Friday,February3,202310、低头要有勇气，抬头要有低气。17:02:3117:02:3117:022/3/20235:02:31PM11、人总是珍惜为得到。2月-2317:02:3117:02Feb-2303-Feb-2312、人乱于心，不宽余请。17:02:3117:02:3117:02Friday,February3,202313、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2月-232月-2317:02:3117:02:31