药物分析课件第04章药物定量分析与分析方法验证

第四章

药物的含量测定方法与验证《药物分析》课件基本要求掌握：药物含量的容量、光谱和色谱分析法，滴定度与含量计算，色谱系统适用性试验的内容、要求及相关计算，样品分析的前处理方法，药物分析方法的验证与内容。熟悉:各类分析法的基本原理与条件选择，样品分析前处理方法的适用范围，不同分析方法对验证内容的基本要求。了解：滴定液的配制与标定，分析仪器的校正和检定。基本内容一、定量分析法的分类与特点二、样品分析的前处理方法三、药品质量标准分析方法验证练习与思考第一节定量分析方法分类与特点一、容量分析法

（一）容量分析法的特点几个概念：容量分析法、滴定终点、滴定误差

操作简单、快速；比较准确（相对误差＜0.2%）；仪器普通易得常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选（二）容量分析法的计算问题

2.滴定度的计算

aA（待测物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1×cT=c×a/b×Mc：滴定液浓度(mol/L)M：被测物分子量

1.滴定度（T）：

每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg)用溴酸钾法测定异烟肼[M(C6H7N3O)＝137.14]的含量时，溴酸钾滴定液的摩尔浓度为0.02mol/L（以KBrO3为单元），化学反应式如下：3C6H7N3O＋2KBrO3→3C6H5NO2+3N2↑+KBr+3H2O3.百分含量的计算W：供试品取样量

设至终点时，消耗滴定液体积为Vml则药物理论质量为V·T浓度校正因数（1）直接滴定法（2）间接滴定法1）生成物滴定法药物+A→B滴定滴定剂2）剩余滴定法（回滴法）药物+A（定、过量）

→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白试验···········································V0W司可巴比妥钠=0.1022g，cBr2=0.05mol/L，cNa2S2O3＝0.1mol/L；V1=15.73ml，V0=23.21ml；MC12H17N2NaO3=260.27，FNa2S2O3＝1.038。司可巴比妥钠的含量测定1.计算滴定度；2.计算百分含量。光谱分析法

紫外—可见分光光度法UV—Vis原子吸收分光光度法AAS荧光分析法

二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml1.特点准确度高，RSD（%）为2%～5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广泛2.朗伯-比耳定律

A=ECL

吸收系数：摩尔吸收系数ε

——

研究分子结构

百分吸收系数

——

含量测定吸收光谱范围：紫外：200～400nm

可见：400～760nm

3.仪器的校正和检定

吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波长处测定

，应符合P91表1中规定波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液，规定波长处测定透光率，应符合P91表2中规定4.对溶剂的要求:含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收它们的使用范围均不能小于截止使用波长

石英吸收池、空气为空白

λ(nm)溶剂+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.055.测定方法确定波长要求供试品溶液的A应在0.3～0.7

狭缝调整供试品溶液的吸光度对照品溶液的吸光度供试品溶液的浓度对照品溶液的浓度5.测定方法1）对照品比较法：条件：A.待测物与对照品在相同条件下测定B.待测物与对照品浓度相近制剂：原料药：稀释倍数取样量平均片重片粉量2）吸收系数法（绝对法）吸光度百分吸收系数液层厚度，cm，如无特别注明，L=1cm可在手册或文献中查到盐酸氯丙嗪（规格1ml:10mg，E1%1cm＝915)的含量测定：精密量取本品5ml，置200ml量瓶中，用盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，在254nm波长处测定吸光度为0.469。计算其百分含量。3）计算分光光度法：

多种，具体按每种药物规定的方法进行如：VA的三点校正法4）比色法加入显色剂后，按照对照品比较法测定。影响显色因素很多，故需注意平行操作。空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理三、色谱分析法

特点：高灵敏度、高效能、高速度、应用广泛

按分离原理：吸附；分配；离子交换；排阻色谱分类按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC

根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最有力手段。1.对仪器一般要求

固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变

其他均可适当改变色谱图20分钟内记录完毕2.系统适用性试验色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2

分离度：R=2（tR2

–

tR1)/(W1+W2);应大于1.5重复性：对照液连续进样5次，峰面积RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2Ａ应在0.95～1.05流出方向（一）HPLC法（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量对照品+内标物→对照溶液，进样，测定，计算校正因子

3.在含量测定中的应用供试品+内标→供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量

（2）外标法测定供试品主成分含量供试品→供试品溶液对照品→对照品溶液进样，测定，计算含量

缺点：不易准确控制进样量，宜用定量环进样1.对GC仪器一般要求

载气：氮气

色谱柱：填充柱或毛细管柱填充柱：内径2～4mm，长1～10m，内装吸附剂高分子多孔小球或涂渍固定液的载体

毛细管柱：内径0.2～0.5mm，长10～100m，一般为空心柱，内壁或载体经涂渍或交联固定液检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕（二）GC法色谱适用性实验、测定法：同HPLC第二节样品分析的前处理方法

第一节定量分析样品的前处理方法一、概述1.结构特征与分析方法之间的关系(2)含金属有机药物

(1)含卤素有机药物R-X（F，Cl,Br,I）卤素与脂肪链相连R-X结合较不牢固，不需有机破坏含金属有机药物R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物；结合不牢固，可直接测定

有机金属药物R-Me

，结合牢固，适当处理后测定

卤素与芳环相连Ar-X结合牢固，需/不需有机破坏泛影酸三氯叔丁醇富马酸亚铁硬脂酸镁醋酸苯汞2.药物分析中常用的分析方法经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法二、不经有机破坏的分析方法终点：邻二氮菲(+Fe3+)溶于热稀矿酸Fe2+铈量法Ce4+Fe3+指示剂:邻二氮菲(+Fe2+)红色淡蓝色（一）直接测定法例如：富马酸亚铁的含量测定（二）经水解后测定法

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH

(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O

NaCl+AgNO3AgCl↓+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN↓+NH4NO3

△

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

1.碱水解后测定法适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃例如：三氯叔丁醇的含量测定

2.酸水解后测定法

例如：硬脂酸镁的含量测定

（三）经还原分解后测定法

指示剂：曙红钠终点：黄→红适用于Ar-I的药物例如：泛影酸的含量测定三、经有机破坏的分析方法－－－－凯氏定氮法金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏药物分析中常用的有机破坏的方法有干法破坏湿法破坏

(一)湿法破坏H2SO4-HNO3法H2SO4-HClO4法H2SO4-硫酸盐法H2SO4-H2O2,HNO3-KMnO4法等（二）干法破坏2.氧瓶燃烧法适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中Se及砷盐的检查1.高温炽灼法加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以助灰化1）仪器装置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶2）称样固体样；液体样；软膏类样品要求3）燃烧分解操作法4）吸收液的选择用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.应用示例：碘苯酯的测定返回第三节药品质量标准分析方法验证均需对分析方法进行验证验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。起草药品质量标准生产工艺变更制剂组分改变原分析方法修订一、准确度是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度1.原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较2.制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响①用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药②向制剂中加入已知量的被测物进行测定③与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较（二）具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98.0%～102.0%；容量法可达99.7%～100.3%回收率试验精密称取盐酸小檗碱约40mg，按处方比例加入其它组分和辅料，用适量沸腾的0.05mol/LH2SO4

溶解。放冷置室温，定量转移至250ml量瓶中，并稀释至刻度。过滤，弃去初滤液，取续滤液5.00ml于100ml量瓶中并稀释至刻度，按所选定的方法计算回收率。测定结果见下表。三波长分光光度法测定连蒲双清片中盐酸小檗碱的含量回收率试验取连蒲双清片粉适量（约相当于盐酸小檗碱40mg)，精密称取，精密加入盐酸小檗碱约40mg

，用0.05mol/LH2SO4

溶解。放冷置室温，定量转移至250ml量瓶中，并稀释至刻度。过滤，弃去初滤液，取续滤液5.00ml于100ml量瓶中定容，按所选定的方法计算回收率。测定结果见下表。三波长分光光度法测定连蒲双清片中盐酸小檗碱的含量2.

相对标准偏差(RSD)

1.

标准偏差（SD或S）二、精密度（一）精密度表示方法（二）验证内容

1.

重复性

在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.

2.

中间精密度

在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。

3.

重现性

在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限三、专属性指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性（一）鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用已验证方法或药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。

四、检测限（LOD)

是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需准确定量，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N＝2或3时的相应浓度来确定检测限。

五、定量限（LOQ)

是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。

杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。六、线性

是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。

回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出r。如UV：制备一个标准系列，浓度点n=5A=0.3-0.7建立回归方程C=aA+b，

r＞0.9999七、范围

如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%～120%制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%～130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的±20%。是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。

八、耐用性

是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。

分析方法效能指标的具体应用：1.用于鉴别试验：只要求专属性、耐用性2.用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：①用于定量：除检测限不要求外，其余指标均要求。②限度检查：只要求检测限、专属性、耐用性3.原料、制剂的含量测定及溶出度测定：不要求检测限和定量限，其余均要求。练习与思考[A型题]1．相对标准偏差表示的应是A．准确度B．回收率C．精密度D．纯净度E．限度2．表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A．相关规律B．比例常数C．相关常数D．相关系数E．精密度

1～4A．空白试验B．对照试验C．回收试验D．鉴别试验E．检测试验1．以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验2．在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验3．用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验4．取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色ACDB[B型题][X型题]1．药物分析方法的效能指标有

A．检测限B．耐用性C．准确度D．专属性E．代表性2．对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有

A．耐用性B．专属性C．检测限D．准确度E．线性与范围3．用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为

A．1∶1B．2∶1C．3∶1

D．4∶1E．5∶1

返回１.在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度称为（）A.精密度B.耐用性C.准确度D.线性E.范围2.用HPLC测得两组分的保留时间分别为8.0min和10.0min，峰宽分别为2.8mm和3.2mm，记录纸速为5.0mm/min，则两峰的分离度为（）

A.3.4

B.3.3

C.4.0

D.1.7

E.6.83.用直接滴定法测定阿司匹林原料药的含量，若供试品的称样质量为m(g)，氢氧化钠滴定液的浓度为c(mol/l)，消耗氢氧化钠滴定液的体积为V(ml)，1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/l)相当于18.02mg的阿司匹林，则含量的计算公式为（）４.准确度是指用某分析方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以（）A.百分回收率表示B.偏差表示C.标准偏差表示D.相对标准偏差表示E.重现性表示５.回收率属于药物分析方法验证指标中的（）

A.精密度B.准确度C.检测限D.定量限

E.线性与范围６.中国药典规定紫外分光光度法测定中，溶液的吸收度应控制在（）

A.0.00～2.00

B.0.3～1.0

C.0.2～0.8

D.0.1～1.0

E.0.3～0.77.GC、HPLC法中的分离度（Ｒ）的计算公式为(

)

１.选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品包括（）

A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.氢气

D.无灰滤纸E.凯氏烧瓶多项选择题２.有机卤素药物常用的测定方法有（）

A.直接回流后测定法B.碱性还原后测定法C.氧瓶燃烧分解后测定法D.直接络合滴定法E.硝酸银标准液直接滴定法３.含卤素及含金属有机药物，测定前预处理的方法可以采用（）

A.碱性还原法B.碱性氧化法C.氧瓶燃烧法

D.碱熔融法E.直接回流法多项选择题４.氧瓶燃烧法可用于（）

A.含卤素化合物的含量测定B.醚类药物的含量测定C.检查甾体激素类药物中的氟D.检查甾体激素药物中的硒E.芳酸类药物的含量测定５.干法破坏应注意的是（）

A.加热温度应在420℃以下，以防止被测金属化合物的挥发

B.应灰化完全

C.样品应先大火加热炭化后，小火加热使样品灰化

D.破坏后不溶的灰分，不应弃去

E.可加入高锰酸钾、H2O2多项选择题一、最佳选择题1．含溴有机化合物经氧瓶燃烧后生（）。A.紫色烟雾B.棕色烟雾C.黄色烟雾D.白色烟雾E.红色烟雾2．测定卤素原子与脂肪碳链相连的含卤素有机药物（如三氯叔丁醇）的含量时，通常选用的方法是（）。A.直接回流后测定法B.直接溶解后测定法C.碱性还原后测定法D.碱性氧化后测定法E.原子吸收分光光度法3．氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为（）。A.H2O2溶液B.H2O2-NaOH溶液C.NaOH溶液D.硫酸肼饱和溶液E.NaOH-硫酸肼饱和溶液4．三氯叔丁醇的含量测定是含卤素药物测定卤素的代表性方法，这种方法是（）。A.酸水解法B.碱水解法C.碱氧化法D.碱熔法E.碱还原法5．含金属有机药物亚铁盐的含量测定一般采用（）。A.氧化后测定B.直接容量法测定C.比色法测定D.灼烧后测定E.重量法测定6．氧瓶燃烧法测定，要求备有适用的（）。A.无灰滤纸，用以载样B.铂丝（钩或篮），固定样品或催化氧化C.硬质磨口具塞锥形瓶（用以贮氧、燃烧、吸收）及纯氧D.A＋B

E.A＋B＋C7．有机卤素药物中的卤原子为芳环的取代基时，为使其转变为无机卤素离子，应该采用的方法是（）。A.将药物溶于溶剂，加碱后，回流使其溶解B.将药物溶于碱溶液，加强还原剂，加热回流，使其裂解C.将药物溶于碱溶液，加强氧化剂，加热回流，使其裂解D.氧瓶燃烧法E.凯氏定氮法8．三氯叔丁醇的含量测定，采用氧瓶燃烧后剩余银量法，以稀硫酸铁铵为指示剂，用硫氰酸铵滴定剩余的硝酸银，在滴定之前加邻苯二甲酸二丁酯的作用是（）。A.防止AgCl转化为AgSCN

B.促使AgCl转化为AgSCNC.防止Fe3＋水解D.防止其他阴离子（如）的干扰E.使终点易于辨认10．三氯叔丁醇采用银量法测定含量，其样品前处理方法为（）。A.碱性条件下回流B.碱性条件下还原C.酸性条件下还原D.酸性条件下水解E.以上都不是11．测定碘与苯相连的含卤素有机药物（如碘苯酯）的含量时，通常选用方法是（）。A.直接回流后测定法B.直接溶解后测定法C.氧瓶燃烧后测定法D.碱性氧化后测定法E.原子吸收分光光度法12．测定氧与金属键相连的含金属有机药物（如富马酸亚铁）的含量时，通常选用方法是（）。A.直接测定法B.汞齐化测定法C.碱性、酸性还原后测定法D.碱性氧化后测定法E.原子吸收分光光度法13．在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度称为（）。A.精密度B.耐用性C.准确度D.线性E.范围14.用直接滴定法测定阿司匹林原料药的含量，若供试品的称样质量为m(g)，氢氧化钠滴定液的浓度为c(mol/l)，消耗氢氧化钠滴定液的体积为V(ml)，1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/l)相当于18.02mg的阿司匹林，则含量的计算公式为（）16．准确度是指用某分析方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以（）。A.百分回收率表示B.偏差表示C.标准偏差表示D.相对标准偏差表示E.重现性表示17．回收率属于药物分析方法验证指标中的（）。A.精密度B.准确度C.检测限D.定量限E.线性与范围18．原料药物分析方法的选择性应考虑下列哪些物质的