耿婷婷-基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立(西北大学硕士学位毕业PPT)

基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立答辩人：耿婷婷导师：陈超崔亚丽GoldMag-AS微米金磁微粒磁内核金外壳金壳层：纳米级金颗粒生物分子固定化容量大

非共价偶联：Au-S相互作用

疏水

静电

磁核心:超顺磁性，易于分离

一背景介绍国家卫生部传染病法定报告：2005年全国发病人数第五位2007年全国发病人数第三位

年份全国梅毒报告病例首例梅毒病例在1979年重庆市报告梅毒螺旋体梅毒在我国已成为一个严峻的公共卫生问题，输血必检项目之一。快速血浆反应素试验;假阴假阳梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验;方便、灵敏度低梅毒螺旋体特异性抗体酶联免疫吸附试验;灵敏度中等梅毒螺旋体核酸检测法；灵敏度高、昂贵梅毒螺旋体特异性抗体化学发光法检测;灵敏度高金磁微粒为载体的化学发光酶免疫检测系统金磁：比表面积大；可自动化操作。化学发光：灵敏度高。二.实验目的1.建立磁酶免化学发光系统检测TP抗体2.血液中TP筛查，提高输血安全性3.血站自动化病原筛查三.实验原理＋HRP化学发光Luminol,H2O2,PIPTMB底物检测吸光度与样品浓度成正比｛＋HRPAg-Ab-酶复合物四、实验设计及结果分析TP抗原免疫磁珠的制备1磁酶免反应条件的优化2化学发光条件的优化3磁酶免化学发光法建立及方法价4（一）TP抗原免疫磁珠的制备磁粒与抗体偶联封闭，清洗，磁性分离，弃上清保存磁粒中加入抗体（一）TP抗原免疫磁珠的制备1.TP抗原在金磁微粒表面的固定化TP抗原包被前后的紫外吸收曲线一步偶联：磁粒表面静电作用；疏水相互作用；半胱氨酸残基侧链的巯基与金的作用等。（一）TP抗原免疫磁珠的制备2.优化免疫磁珠的包被时间1min、5min、10min、15min、20min、30min、60min20min左右即可完成偶联反应选取30min为最佳包被时间（一）TP抗原免疫磁珠的制备3.选择磁粒的浓度：10µg/孔、30µg/孔、50µg/孔、100µg/孔

过低：阳性值低过高：磁粒不透光影响发光信号选择：30µg/孔磁粒浓度（

µg/孔）化学发光信号（一）TP抗原免疫磁珠的制备4.优化封闭反应条件：阳性阴性阳性／阴性4℃过夜1.9061.8840.0800.07324.7737℃2h+4℃过夜1.7451.8150.0300.01972.65常用封闭条件为4C过夜，但实验中发现4C过夜并不适用于金磁微粒的封闭，达不到理想的封闭效果，阴性值较高。磁性微粒4C过夜时基本完全沉降在管底，不能充分反应导致。

增加37C震荡2h，明显加强了封闭效果，阴性值较低。（一）TP抗原免疫磁珠的制备5.选择合适封闭剂1％明胶、10％小牛血清、0.5%BSA、5%奶粉、10%奶粉、

5％奶粉＋2％小牛血清

阳性阴性阳性／阴性1%明胶——————————10%小牛血清1.7651.7230.4960.4353.750.5％BSA2.2992.160.2530.3137.885%奶粉2.2272.3090.1780.14214.1810%奶粉——————————5％奶+2％小牛血清1.7451.8150.030.01972.65（二）TP抗体的免疫学结合双抗原夹心法检测1.选择HPR标记抗原稀释液:20％小牛PBST降低非特异性吸附：加入非特性蛋白加入表面活性剂酶标抗体稀释液吸光度值编号稀释液阴性1PBS0.230±0.0302PBST0.213±0.0503PBST+5%小牛血清0.137±0.0434PBST+10%小牛血清0.115±0.0555PBST+20%小牛血清0.015±0.0306PBST+30%小牛血清0.012±0.040（二）TP抗体的免疫学结合（二）TP抗体的免疫学结合2.优化免疫反应时间包被抗原、待检抗体、酶标抗原的结合是一个动态平衡反应，分别考察反应时间为10、15、25、30、40、50min时的检测结果时间(min)吸光度值阳性对照阴性对照3.选择包被抗原浓度

2.5µg/mg、5µg/mg、7.5µg/mg、10µg/mg、12.5µg/mg、15µg/mg

×HRP√HRPHRP×抗原包被量（µg/mg）发光信号（二）TP抗体的免疫学结合

2.5

5

7.51012.515

4.选择HPR标记抗原的浓度

2.557.51012.5151:2000PN0.7850.0241.2870.0091.2400.0201.6800.0231.5640.0111.6700.0101:3000PN0.8550.0181.1570.0131.2830.0001.2720.0101.4930.0231.2830.0001:4000PN0.6530.0051.0200.0171.0260.0151.0700.0001.2840.0281.0780.0111:5000PN0.6640.0150.8630.0180.8880.0020.9700.0010.9460.0050.8360.0301:6000PN0.5110.0100.7330.0130.6990.0020.7980.0210.6800.0070.6260.017（二）TP抗体的免疫学结合酶标抗体稀释度抗原包被量最佳工作条件:TP抗原包被量为5µg/mg酶标抗原为1:3000稀释（三）化学发光条件的优化1.选择反应体系Tris阳性阴性发光太弱CBS阳性阴性均发光HRPLuminolH2O2PIPabTris体系发光结果相对光子数时间（s）阳性阴性abab相对光子数时间（s）阳性阴性ab

CBS体系发光结果PBS阳性发光，阴性不发光PBST阳性发光，阴性不发光PBS体系发光结果ab相对光子数时间（s）阳性阴性abab相对光子数时间（s）阳性阴性abPBST体系发光结果（三）化学发光条件的优化（三）化学发光条件的优化2.缓冲体系中Tween-20浓度的影响Tween20浓度(v/v)发光信号吐温0.3％0.2％0.15％0.1％0.05％0.0％阳性75922852369296131661989阴性383838304630空光剂7676918411484（三）化学发光条件的优化3.选择pH值pH6.577.588.5阳性129592280946551352阴性883011499空白8882323发光剂88815152pH值发光信号（三）化学发光条件的优化4.选择luminol浓度1.25×10-31×10-30.75×10-30.5×10-30.25×10-3阳性2856534487332122933921648阴性7684535330空白3838382315发光剂311258167144121Luminol浓度（mol/L）相对光子数（三）化学发光条件的优化5.选择H2O2浓度1.81.51.20.90.60.3阳性180019132392262723311192阴性463023232323空白38382315158发光剂536161383015H2O2浓度(μl/mL)发光信号（三）化学发光条件的优化6.选择PIP浓度6×10-35×10-34×10-33×10-32×10-31×10-3阳性249129013121321228701450阴性383838304630空白1588232312发光剂616165848491PIP浓度(mol/mL)发光信号＋HRP化学发光Luminol,H2O2,PIP＋HRPAg-Ab-酶复合物（四）磁酶免化学发光方法的建立及评价1.磁酶免化学发光法标准曲线测定R2=0.9988阳性血清梯度稀释发光信号（四）磁酶免化学发光法的建立及评价将阳性血清梯度稀释，线性关系良好y=10406x-4.619（四）磁酶免化学发光法的建立及评价2.磁酶免化学发光法与其他方法灵敏度的比较以金磁微粒为固相载体进行酶免检测，灵敏度提高2倍。结合化学发光检测，灵敏度可提高16倍。阳性血清稀释倍数检测结果商品化试剂盒磁酶免法磁酶免化学发光法1:25+++1:50+++1:100+++1:200+++1:400-++1:800-+-+1:1600--+1:3200--+1:6400--+-1:12800---（四）磁酶免化学发光法的建立及评价3.磁酶免化学发光检测方法的精密度在线性范围内选取1:400稀释的阳性血清，重复测定11次，计算测定值的相对标准偏差RSD=5.5%。

磁分离化学发光免疫法检测阳性样品11次重复测定相对光子数五：全文总结优化磁酶免反应条件优化化学发光条件制备免疫磁珠包被时间的选择选择抗原包被量选择磁粒用量优化封闭反应条件封闭剂的选择HPR标记抗原稀释液的选择优化免疫反应时间选择抗原包被浓度选择HPR标记抗原的浓度选择反应体系缓冲体系中Tween-20浓度选择pH值选择lumino