分子生物学 转录及其调控

第三章转录及其调控遗传信息由DNA转换到RNA的过程。蛋白质生物合成的第一步，合成mRNA以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）转录(transcription)多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向.转录特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基

因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制（2）转录是不对称的(3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。一、所需因素第一节原核生物转录1.转录模板DNA模板：指导RNA合成的一股DNA链称为模板链（templatestrand），与之相对的另一股链为编码链（codingstrand）.2.RNA聚合酶（RNApolymerase）RNA聚合酶有以下特点：（1）无需引物的存在能独自起始新RNA链

的合成（2）没有校对能力；（3）催化的底物是核糖核苷三磷酸。大肠杆菌只有一种RNA聚合酶，负责所有rRNA、mRNA和tRNA的合成。该酶具有全能性，基本上不需要其他蛋白因子的参与，即可独立的进行。功能：（1）识别DNA双链上的启动子（2）通过阅读启动子序列，确定转录方向和模板链（3）解开DNA部分双螺旋，产生约17bp的单链DNA模板（4）选择正确的核糖核苷三磷酸（rNTP）底物并催化形成磷

酸二酯键，使合成的RNA链不断延伸。（5）最后当它达到终止子时，识别转录终止信号，停止转录。大肠杆菌RNA聚合酶结构：5种亚基组成：两个α亚基、1个β亚基、1个β′亚基

和1个δ亚基。转录的起始阶段：

δ亚基和核心酶（α2ββ′）组装成全酶共同起作用。δ亚基无催化活性，但它能识别启动子并将封闭的启动子复合物转换成开放状态。一旦转录起始，δ亚基就从全酶上脱离下来。核心酶与模板DNA结合的亲和力弱，特异性差，这有利于它在模板链上移动，促进转录延伸。σ因子负责识别启动子的保守序列，不同的σ因子识别不同的启动子。许多细菌能产生多种可取代的σ因子，以识别不同的启动子。σ因子大肠杆菌只有一种RNA聚合酶，负责所有rRNA、mRNA和tRNA的合成。并且该酶具有全能性，基本上不需要其他蛋白因子的参与，即可独立的进行转录的起始、延伸和终止。一些抗生素，如利链菌素，可以抑制原核生物的RNA聚合酶，使得原核生物的基因无法转录成mRNA，从而达到杀死细菌等原核生物的效果。1.转录起始1）全酶与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动。2.起始识别：全酶与-35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物。3.全酶紧密地结合在-10序列处，DNA模板局部变性，形成开放的启动子二元复合物。（RNA聚合酶与启动子结合后造成约10bp的DNA解链）4.合成短多聚核苷酸（<10nt),三元复合物形成。（酶-启动子-NTP）5.σ因子从全酶中解离下来，聚合酶转变为延长构型。酶分子与启动子特异性结合性的结合力下降，延伸阶段开始。二、原核生物转录的起始延伸转录延长三、转录的终止终止序列和释放因子终止子：提供终止信号的序列。

分为两类：

不依赖ρ因子而实现终止作用。

依赖ρ因子才能实现终止作用。ρ因子---蛋白质辅助因子不依赖ρ因子终止作用：

在转录终止点之前有一段回文序列，回文序列的两个重复部分之间由几个碱基对的不重复阶段隔开依赖于ρ因子终止作用ρ因子是55KDa蛋白，其活性形式为六聚体1）促进转录终止活性2）NTPase活性，需要RNA链。转录单元是一段被转录成单链RNA的DNA序列，它起始于启动子，结束于终止子。一个转录单元可能包含不止一个基因。一、所需因素转录起始需要启动子，RNA聚合酶和转录因子参与。1.转录起始前的上游区具有启动子核心序列。不同物种、不同细胞或不同的基因转录起始点上游有不同的DNA序列，统称为順式作用元件（cis-actingelement).順式作用元件包括启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远隔序列。第二节真核生物转录起始点上游多数有共同的TATA序列，称为TATA盒。（启动子核心序列）启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点约-40~-100nt的位置，常见的是GC盒和CAAT盒。增强子-能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。结构基因順式作用元件2.真核生物有三种DNA依赖RNA聚合酶

真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助。能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，已发现数百种。统称为反式作用因子（trans-actingfactors)反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的称为转录因子（transcriptionalfactors,TF).3.转录因子真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物（pre-initiationcomplex,PIC).第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶Ⅱ共同组成转录起始复合物，转录才能在正确的位置开始。TFⅡD,TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它们在转录起始复合物组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这此TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。根据转录因子的作用特点可分为二类转录起始内部启动子的起始各阶段，涉及三个起始因子1.原核生物聚合酶仅有一种，有多个亚基。真核生物有三种DNA依赖性RNA聚合酶，有两个不同的大亚基和十几个不同的小亚基。2.原核生物RNA聚合酶可直接结合DNA模板，而真核生物RNA聚合酶与辅助因子结合后才结合模板。3.转录起始：原核生物RNA聚合酶要结合到DNA模板上，DNA双链局部打开，使其中一条链作为转录模板。真核生物转录起始前的上游区段具有启动子核心序列，RNA聚合酶不能直接结合模板，RNA聚合酶II启动转录时需要转录因子才能形成转录复合物。原核生物与真核生物转录起始调控差异当合成一段含有60-70个核苷酸的RNA时，TFIIＥ和TFIIH释放，RNA聚合酶II进入转录延长期。终止无特定的终止子序列可在无辅助因子参与下终止一串A残基终止转录mRNA:识别末端加尾信号RNA转录后加工和修饰绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始在DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程，相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分天的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA。hnRNA分子中大约只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其余部分将在转录后的加工过程中被降解掉。三、真核生物RNA成熟真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，即一个mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。（一）真核生物mRNA加工修饰1．在5’端加帽成熟的真核生物mRNA，其结构的5’端都有一个m7G-PPNmN结构，该结构被称为甲基鸟苷的帽子。2．在3’端加尾

大多数的真核mRNA都有3’端的多聚尾巴（A)，多聚（A)尾巴大约为200bp。

多聚（A)屠巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNA的游离3’-OH端，并加上约200个A残基。在大多数真核基因的3’一端有一个AATAA序列，这个序列是mRNA3’-端加polyA尾的信号。靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键，在polyA聚合酶催化下，在3’-OH上逐一引入100-200个A碱基。3.mRNA前体（hnRNA）的剪接（splicing)真核生物基因往往是断裂基因，即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一个真核生物结构基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一个很小的蛋白质，它结构基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的结构基因中可以有几十个内含子。经过复杂的过程后，切去内含子，将有编码意义的核苷酸片段（Extron，外显子）连接起来

内含子与外显子接界处的高度守恒序列,为准确和有效的剪接过程所必需。內含子5′末端与外显子接界序列为CAAG/GTAGAGT,而3′末端与外显子接界序列为(TC)_πN(CT)AG/G。内含子序列内的各种缺失,并不影响剪接的准确和效率,这似乎说明,内含子的其他部份并不为剪接所要求。mRNA的剪接是基于对间接位点识别的基础上，由被称为剪接体的核酸蛋白复合物完成剪接体包含5种SnRNP和超过200种蛋白质因子。hnRNA的剪接过程不论拼接过程如何，拼接必须极为精确，否则会导致遗传信息传递障碍，合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。我国南方广大地区是β-地中海贫血的高发区，这是由于β-珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。实验表明β-珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序，结果造成错误部位的拼接。加工成熟的mRNA虽能翻译，但产物不是正常的β-珠蛋白，结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。（二）rRNA转录后加工原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基真核生物rRNA前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为45s，低等真核生物的rRNA前体为38s，真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录。真核生物rRNA前体中含有插入顺序，rRNA前体要形成成熟的rRNA，需要经过拼接反应。例如，四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。四膜虫基因组内，26srRNA编码的区域内有413bp的插入顺序。该插放序列可以不消耗能量从rRNA前体中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性办法，都不能破坏拼接活性，但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入顺序5’端发生亲核反应，同时GMP与5’端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。第二步是5’切点的外元3’-OH与3’切点的外元5’-P共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一个环状结构，同时从5’端去掉一个15核苷酸碎片。剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再经过几步，最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的。不只是沟通核酸和蛋白质的桥梁，可能是功能比DNA更广泛的信息分子。（三）tRNA转录后的加工修饰原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性，需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3’-OH连接-ACC结构①tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大肠杆菌RNaseP可特异剪切tRNA前体的5’旁顺序，因此，该酶被称为tRNA5’成熟酶。除了RNaseP外，tRNA前体的剪切尚需要一个3’-核酸内切酶，这可将tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切下来。RNaseD是tRNA3’端成熟酶。近年来的研究表明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白质组成，最近发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下，可以单独地催化tRNA前体的加工成熟，这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA分子确具有酶的催化活性。经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。在核苷酸转移酶作用下，3’--末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。tRNA3’-末端-CCA序列的添加成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基，因此tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸（Ⅰ）tRNA的碱基修饰RNA编辑（RNAediting)RNA编辑是指在mRNA水平上改变遗传信息的过程.具体说来，指基因转录产生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失，插入或置换，基因转录物的序列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成，不同于基因序列中的编码信息现象。RNA编辑是通过比较成熟的mRNA与相应基因的编码信息时发现的，成熟的mRNA序列中有几种意想不到的变化，包括尿嘧啶（U）突变为胞嘧啶（C）、胞嘧啶突变为尿嘧啶、尿嘧啶的插入或缺失、多个鸟嘌呤（G）或胞嘧啶的插入等。最典型的例子是锥虫(Trypanosome)动质体(kinetoplastid)的线粒体基因mRNA的编辑,涉及上百个尿嘧啶的缺失和插入。由于RNA编辑是基因转录后在mRNA中插入、缺失或核苷酸的替换而改变DNA模板来源的遗传信息，翻译出多种氨基酸序列不同的蛋白质，RNA编辑的结果不仅扩大了遗传信息，而且使生物更好地适应生存环境。有些基因的主要转录产物必须经过编辑才能有效地起始翻译，或产生正确的可读框(ORF)。例：组织靶标RNA所改变的碱基结果肝，肠肌肉睾丸，肿瘤等肿瘤脑载脂蛋白B半乳糖苷酶Wilms肿瘤基因-1神经纤维瘤基因-1谷氨酸受体蛋白C→UU→AU→CC→UA→I谷氨酰胺密码子→终止子苯丙氨酸密码子→酪氨酸亮氨酸密码子→脯氨酸精氨酸密码子→终止子多个谷氨酸密码子→精氨酸RNA编辑机制核苷的插入或删除编辑碱基替换编辑单碱基突变（apoB)RNA的编辑类型RNA编辑影响了基因的表达，生成不同的氨基酸和新的开放读码框。RNA编辑同基因的选择剪接或可变剪接(alternativesplicing)一样，使得一个基因序列有可能产生几种不同的蛋白质，这可能是生物在长期进化过程中形成的、更经济有效地扩展原有遗传信息的机制。一、原核生物转录调控(ControlofProkaryoticGeneExepression)原核生物在对外环境突然变化的反应中，是通过诱导或阻遏合成一些相应的蛋白质来调整与外环境之间的关系。由于原核生物的转录与翻译的过程是偶联的，而且这种过程所经历的时间很短，只需数分钟，同时由于大多数原核生物的mRNA在几分钟内就受到酶的影响而降解，因此就消除了外环境突然变化后所造成的不必要的蛋白质的合成。与真核生物相比，原核生物基因表达的一个特点是快速。主要在转录起始水平调控第三节转录调控σ因子对转录的调节

操纵子对转录的调节（一）调控特点：

（二）调控机制Lac操纵子（负调控）Trp操纵子参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵基因受负的控制，而同时又同步地受支配。细菌相关功能的结构基因常连在一起，形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控，这一个完整的调节系统包括结构基因和控制这些基因表达的元件，形成了一个共同的调节单位，这种调节单位就称为操纵子（opron）。操纵子的活性是由调节基因控制的，调节基因的产物可以和操纵子上的顺式作用控制元件相互作用。乳糖操纵子

例1大肠杆菌乳糖酶诱导合成阻遏蛋白操纵基因结构基因半乳糖苷酶半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透性酶操纵基因——基因合成的开关调节基因关——阻遏蛋白阻挡操纵基因，结构基因不表达诱导物（乳糖）开——诱导物阻止阻遏蛋白功能发挥。mRNA酶蛋白乳糖操纵子调控的机制

lacZ编码β-半乳糖苷酶，此酶由500kd的四聚体构成，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖

lacY编码β一半乳糖苷透性酶，这种酶是一种分子量为30kDd膜结合蛋白，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。

lacA编码β-半乳糖苷乙酰转移酶，其功能只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到β-半乳糖苷上。

无论是lacZ发生突变还是lacY发生突变却可以产生lac-型表型，这种lac—表型的细胞不能利用乳糖。lacZ-突变体中半乳糖苷酶失去活性，直接阻止了乳糖的代谢。lacY-突变体不能从膜上吸取乳糖。

lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。lac基因簇是受到负调节（negativeregulation）。它们的转录可被调节蛋白所关闭。

lacI的产物称为lac阻遏物（lacrepressor），其功能是和lacZ、Y、A基因簇5′端的操纵基因（lacO）,操纵基因位于启动子(lacP)和结构基因（lacZYA）之间。当阻遏物结合在操纵基因上时就阻碍了启动子上的转录起始。lacO从mRNA转录起始点的上游-5处延伸到转录单位+21处。阻遏蛋白的负性调节：在缺乏诱导物（乳糖）时，这些基因不能转录，因为阻遏蛋白是活性状态结合在操纵基因上。lac阻遏物（lacrepressor）由lacI产生，其功能是和lacZ、Y、A基因簇5′端的操纵基因（lacO）,操纵基因位于启动子(lacP)和结构基因（lacZYA）之间。乳糖操纵子的调控机理有乳糖时在此系统中的诱导物并非乳糖本身,而是乳糖的同素异形体,称为异乳糖(allolactose)。乳糖进入E.coli细胞,被转化成异乳糖。异乳糖与阻遏蛋白结合后,它们即从操纵基因上解离下来,lac操纵子基因即开始表达。β半乳糖苷酶的浓度可以增加1000倍之多。一个诱导物分子结合在阻遏蛋白的特异部位上,引起阻遏蛋白构象的改变,结果使阻遏蛋白从操纵基因上解离下来。有乳糖时，乳糖受β-半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖，与R结合使R构象变化，R四聚体解聚而与O解离。特殊底物的存在导致了酶的合成，此现象称为诱导（induction）。这种类型的调控广泛存在于细菌中，在较低等的真核生物（如酶母）也有这种情况。当E.coli生长在缺乏β一半乳糖苷的条件下是不需要β-半乳糖苷酶的，因此细胞中含量很低，大约每个细胞不高于5个分子，当加入底物后细菌中十分迅速地合成了这种酶，仅在2-3分钟之内酶就可以产生并很快增长到5000个分子/每个细胞。如在酶的浓度将达到细胞总蛋白的5-10%。如在培养基中除去底物，那么酶的合成也就迅速停止，恢复到原来的状态。阻遏蛋白的活性受到小分子诱导的控制

负反馈：细胞质中有了β—半乳糖苷酶后，便催化分解乳糖为半乳糖和葡萄糖。乳糖被分解后，又造成了阻遏蛋白与操纵基因结合，使结构基因关闭。一些乳糖类似物不能被β-半乳糖苷酶分解，却也能与R特异性结合而使其构象改变，诱导1ac操纵子的开放。如异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)是很强的非代谢性诱导剂；X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）也是一种人工合成的半乳糖苷，可被β-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应用在分子生物学和基因工程工作中。CAP-分解（代谢）物基因结合蛋白CAP的正性调节作用1ac操纵子的强诱导既要有乳糖又要无葡萄糖。乳糖操纵子属于可诱导操纵子(inducibleoperon)，在缺乏诱导物时，这类操纵子只有本底水平的表达，约为诱导时表达水平的0.1%左右，lac操纵子的表达水平在诱导和阻遏之间的差别在103倍。这也与阻遏蛋白的量有关，若阻遏蛋白少于10个/细胞，就不可能建立起严密的阻遏。

色氨酸操纵子(tryptophaneoperon)代表了一种衰减调控模式。Trp是构成蛋白质的组分，当有足够的Trp时，操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。缺乏Trp时，Trp操纵子被打开，5个结构基因表达，产生3个酶催化分支酸合成为Trp。色氨酸操纵子(trpoperon)1.负调控合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群；受其上游的启动子P和操纵子O的调控。调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群，在其自身的启动子作用下，以组成性方式低水平表达调控蛋白R’。R’并无活性，当提供足够的Trp时，Trp与R’结合使其构象改变而成为活性形式R，R可与O特异性结合，阻遏结构基因的转录，R的阻遏能力仅为lacI产物的1/1000。调控机理当Trp达到一定浓度，但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时，产生Trp合成酶类的量已经明显