生物：12《基因工程的基本操作程序》ppt(新人教版选修3)

1.“分子手术刀”是_______________，主要来源于_________________。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：________和_____

_。2.“分子缝合针”是__________，分为两类：

和

。3.“分子运输车”是__________，种类：_______________、____________________、_________________。4.载体具备的条件①能够在宿主细胞中______________并稳定保存。②有一个或多个___________切割位点，供外源基因插入。③具有特殊的________________________，共重组DNA的鉴定和选择。

④对受体细胞

。5.—GAATTC——CTTAAG—被切割后形成的片段是：

和

。基因工程的基本操作程序餐前小菜原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码餐前小菜味道如何？思考：启动子与起始密码子，终止子与终止密码子是否相同，如不同有何区别？启动子、终止子：在

上，分别表示

的开始与结束起始密码子、终止密码子：在

上，分别表示

的开始与结束转录翻译DNARNA正餐开始。。。基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成(1)从基因文库中获取目的基因1、什么是基因文库？2、什么是基因组文库？3、什么是部分基因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本第9页的相关内容，回答以下问题自主学习(1)从基因文库中获取目的基因2、什么是基因组文库？3、什么是部分基因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本9页的相关内容，回答一下问题自主学习

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)(1)从基因文库中获取目的基因3、什么是部分基因文库？4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本9页的相关内容，回答一下问题自主学习

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库：基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库(1)从基因文库中获取目的基因4、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？5、目的基因的有关信息与什么相联系？阅读课本9页的相关内容，回答一下问题自主学习

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库：基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库部分基因组文库：基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.（如cDNA文库）基因组文库与部分基因文库的关系阅读课本P10生物技术资料卡

提出你的疑问？提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存cDNA文库的构建-----反（逆）转录法：

基因组文库和cDNA文库的比较小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③前提：_______________________②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA双链复制指数2n要有一段已知目的基因的核苷酸序列自主学习阅读课本P10-P11页的相关内容，回答一下问题（2）利用PCR技术扩增目的基因⑤过程：

过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环进一步思考：在这个过程中都需要什么条件？模板DNA；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；能量；DNA引物；具体过程PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶、原料、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制主要细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：（3）、人工合成的目的基因牛刀小试《同步练习册》P6基础巩固1、3从前你要扩增DNA，

总有培养大批细胞的重任要你背。

这时有个家伙叫KaryMullis博士的，

他钻出来说体外合成也一样OK！

只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，

还有核苷和聚合酶。

变性，退火，和延伸。

加热~冷却~加热~太神奇了！

当你想要检测突变，来啊做PCR吧！

当你想要基因重组，来啊做PCR吧！

当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧！

当你想要侦破大案，来啊做PCR吧！二、基因表达载体的构建——核心问题1．为何要构建基因表达载体？

问题2．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？问题3．基因表达载体的构建需要哪些工具酶，如何将目的基因与运载体连接起来形成重组DNA分子（以质粒为运载体）？问题4．将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质粒？

小组讨论：a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用问题2：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？二、基因表达载体的构建——核心问题1：为何要构建基因表达载体？1.基因表达载体的作用：2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA聚合酶结合位点位于基因的尾端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞问题3：基因表达载体的构建需要哪些工具酶？如何将目的基因与运载体结合起来形成重组DNA分子（以质粒为运载体）？工具酶：限制酶、DNA连接酶质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同种过程:问题4：将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果，怎样从中筛选处所需要重组质粒？

目的基因-目的基因连接物目的基因-载体连接物载体-载体连接物例1．图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________、_______________、_______________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_______________。（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_______________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是___________

____。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是___________，其合成的产物是___________。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_______________。

分离纯化载体-载体连接物目的基因-载体连接物、载体-载体连接物启动子mRNAEcoRI和BamHI目的基因-目的基因连接物目的基因-载体连接物载体-载体连接物①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意转化

——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——用Ca+处理细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持

和

的过程受体细胞稳定表达步骤三：将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法（成本高）（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵移植到子宫或输卵管受精卵发育新性状动物受体细胞是什么？为什么采用受精卵？体积大，易操作；全能性高3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNACa2+处理：可增大细胞壁的通透性，使重组质粒能够导入到受体细胞将目的基因导入受体细胞中的方法的比较农杆菌转化法,基因枪法，花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法体细胞受精卵原核细胞目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA→表达目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子(四)目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交知识延伸——DNA分子杂交技术

该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。返回(四)目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原-抗体杂交2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质①方法:分子杂交方法:抗原-抗体杂交②过程:

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA(四)目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原-抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗