第一章-(基因工程)-绪论

基因工程(GeneEngineering)授课老师：杨帆电话子邮件：yangfan0808@163.com生物工程系考核方法平时成绩30%闭卷考试70%填空题20%出勤回答问题每章课程总结名词解释20%简答题30%100%单项选择10%论述题20%本课程的性质和任务

《基因工程》是在我们生命科学学院各专业中的一门非常重要的专业课。它是在微生物、遗传学和分子生物学等课程的基础上而开设的。通过这门课程的学习，希望学生掌握基因工程的基本原理和应用设计策略，为今后进一步的研究生学习、科研和工作打下重要的理论基础。教学目的深入理解分子生物学知识；启发科学思维方法；掌握基因工程技术的基本原理和技术；课堂理解消化吸收90%以上；掌握一定的专业英语词汇。学习要求掌握基因克隆的基本工具；特别是不同的载体、工具酶。克隆基因的基本方法。利用基因工程生产重组蛋白，基因工程在医药和农业上的应用。能够设计一个基因克隆、表达的程序。授课计划第一章绪论（2学时）第二章基因工程的酶学基础（4学时）第三章基因克隆的载体（4学时）第四章基因工程的主要技术及其原理（6学时）第五章目的基因的获得（4学时）

第六章大肠杆菌基因工程（4学时）

第一章绪论第一节基因和基因工程

第二节基因工程的发展历程和理论基础第三节基因工程的诞生与发展第四节基因工程的意义与发展前景

第一章绪论

生物技术包括四大工程技术基因工程技术、细胞工程技术、蛋白质及酶工程技术、发酵工程技术基因工程技术是生物技术的核心和关键，是主导技术细胞工程技术是生物技术的基础蛋白质及酶工程技术是生物技术的条件发酵工程技术是生物技术获得最终产品的手段生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞工程技术最为突出。一、基因（gene）1.基因——生命的载体

基因是生物遗传信息的载体，它是由核苷酸序列(通常为DNA)组成的生物大分子，决定着生物的所有性状、行为和疾病的发生。它是遗传物质的最小功能单位。

基因工程理论依据

不同基因具有相同的物质基础，所有生物的DNA的基本结构都是相同的。基因是可以切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因通过复制把遗传信息传给下代2.基因是福音

发现了某疾病基因，就可以对患者进行基因水平上的治疗，从根本上根除疾病的危害。

3.基因是企业家的聚宝盆巨大的市场：基因工程药物潜在的市场：肥胖基因（2000万美元）4.基因是铁的证据

基因分析在重大犯罪案件、历史案件的侦破中是最终确定罪犯的有力工具，当事人的头发、血、皮屑的基因分析都将作为确凿证据。

二、基因工程概念

基因工程(geneengineering):就是对不同生物的遗传物质，在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖（绕过有性生殖），并使所需要的基因在细胞中表达，产生出人类所需要的产物或组建成新的生物类型。又名遗传工程（GeneticEngineering)DNA重组技术(RecombinantDNATechniques)分子克隆（MolecularCloning)基因工程最突出的优点

就是打破了常规育种难以突破的物种之间界限，可使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间、甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。

缩短了新物种出现的时间。基因工程的基本操作程序

生物材料人工合成cDNA文库mRNA目的基因基因组文库DNA克隆载体酶切+重组DNA受体细胞导入克隆子筛选转基因生物基因工程技术路线1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）2、DNA片段和载体的连接——重组体DNA3、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库4、选择基因（目的基因）5、目的基因表达切接转选表达基因工程技术路线基因工程四大要素：

供体基因

载体

工具酶

受体细胞

（细菌、植物和动物）基因工程的发展历程和理论基础一、基因工程诞生的理论基础（一）理论上的三大发现

1.DNA是生物的遗传物质（基因工程的先导）

1944年，美国微生物学家O.T.Avery首次证实遗传物质的基础是DNA，基因位于DNA上。肺炎双球菌转化实验

S型肺炎球菌

R型肺炎球菌加热杀死混合老鼠死老鼠活老鼠活老鼠死

S型肺炎球菌

R型肺炎球菌40年代，DNA是遗传物质被证实1944年，美国洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果。

（1）S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌；（2）经DNase

处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。（3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。不仅证实了DNA是遗传物质，而且证明了DNA可以将一个细菌的性状转给另一个细菌，他的工作被称为是现代生物科学的革命性开端。基因工程的发展历程和理论基础2.揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。基因工程的发展历程和理论基础1966年Nireberg等破译了全部64个遗传密码3.遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定基因工程的发展历程和理论基础DNAmRNAProteintranscriptiontranslation

1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”(centraldogma)，揭示了遗传信息的流向和表达问题。基因工程的发展历程和理论基础一、基因工程诞生的理论基础

（二）技术上的三大发明1.限制性核酸内切酶的发现与DNA切割

1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶HindII。1972年Boyer等相继发现了ＥcoRI一类重要的限制性内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖基因工程的发展历程和理论基础2.DNA连接酶的发现与DNA片段的连接

1967年世界上5个实验室几乎同时发现DNA连接酶；

1970年Khorana实验室发现T4DNA连接酶。

3.基因工程载体的研究与应用

1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。理论上的三大发现：证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）——

明确了遗传的物质基础问题DNA的双螺旋结构和半保留复制机理——

解决了基因的自我复制和传递的问题遗传信息的传递方式（“中心法则”和“操纵子学说”，成功破译遗传密码）——

阐明了遗传信息的流向和表达问题技术上的三大发现：限制性内切酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）DNA连接酶的发现载体的使用基因工程的发展历程和理论基础

基因工程的发展历程和理论基础二、基因工程的诞生

(一）Berg的开创性实验

1972年美国斯坦福大学Berg博士领导的研究组用EcoRI在体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体DNA分别酶切，然后用T4DNA连接酶将两种酶切片段连接，结果获得了SV40和λ噬菌体DNA的重组DNA分子，成功完成了世界上第一次DNA体外重组实验，并因此与Gilbert、Sanger分享1980年度诺贝尔化学奖。基因工程的发展历程和理论基础EcoRIrecognitionsites

λphageDNAEcoRIcutsDNAintofragments

StickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairing

DNAligaseRecombinantDNA1972年第一个DNA重组分子产生基因工程的发展历程和理论基础

(二）Boyer-Cohen实验

1973年，Cohen等人将编码Kan抗性基因质粒R6-5和编码Tet抗性基因质粒pSC101混合后，加入EcoRI进行酶切，用T4DNA连接酶连接成重组DNA分子，最后转化大肠杆菌，结果某些转化菌落表现出既抗Kan又抗Tet的双重抗性特性。从这种双抗性转化菌落的大肠杆菌中分离出的重组质粒DNA带有完整pSC101分子和一个来自R6-5质粒编码Kan抗性基因DNA片段。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。Cohen等的重组实验示意图pSC101R6-5TcrNerEcoRIEcoRI连接酶TcrNer双抗重组菌落基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化基因工程的诞生与发展三、基因工程的发展

(一）艰难阶段

主要关注安全性问题

(二）逐渐成熟阶段

1977年第一次实现基因在原核生物中的表达

(三）迅速发展阶段

20世纪80年代以后，高等动植物的遗传转化。基因工程的诞生与发展发展过程中的重大事件：1977年，E.coli中合成了人生长激素基因。1978-1979年，胰岛素基因在大肠杆菌中表达。1982年，培育出了超级鼠。1985年，Horsch发明了植物基因工程的基本方法：

叶圆盘法，并获得转基因植株。1990年，患有遗传免疫疾病的4岁女孩接受了基因疗法。1990年，Perlak将B.T.基因导入棉花获得抗虫棉。1991年，美国开始人类基因组计划。1997年，“多利”绵羊诞生。基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容

（一）基础研究构建克隆载体及相应的表达系统、基因不同物种的基因组文库和cDNA文库、开发新的工具酶、基因工程新技术、新的操作方法。基因工程研究的主要内容（二）克隆载体研究基因工程的发展是与克隆载体构建密切相关的；

Ti质粒的发现使植物基因工程研究迅速发展起来；动物病毒克隆载体的构建，使动物基因工程研究也有一定的进展。可以认为构建克隆载体是基因工程技术路线中的核心环节。构建适合于高等动植物转基因的表达载体和定位整合载体是今后研究的重要内容。基因工程研究的主要内容（三）受体系统的研究

基因工程的受体细胞与载体是一个系统的两个方面。受体是克隆载体的宿主，是外源目的基因复制和表达的场所。受体：单细胞、组织、器官和个体均可以作为受体。原核生物受体：E.coli真核生物受体:酵母是单细胞真核生物受体植物受体：愈伤组织、细胞和原生质，部分组织和器官；动物受体：生殖细胞和早期胚胎细胞作为基因工程受体；人的体细胞也可以作为基因工程受体。基因工程研究的主要内容（四）目的基因研究

基因工程研究的基本任务：开发人民需要的基因产物，这样的基因叫做目的基因。

获得目的基因的方法：主要通过构建基因组文库或cDNA文库，从中筛选出特殊需要的基因。基因：医药相关的基因；抗病、虫害和恶劣环境的基因；特殊营养价值的蛋白或多肽的基因。

基因工程研究的主要内容（五）生物基因组学研究

嗜血流感杆菌：1830137bp，1743个基因产甲烷球菌：1664976bp，1682个基因大肠杆菌K-12：4639221bp，4288个基因枯草杆菌：4.21×106bp,4100个基因

1980年提出HumanGenomeProject(HGP)；

1990年开始，美国、英国、日本、德国、法国等国实施“人类基因组计划”；我国1999年9月获准参加这一计划，承担1%的测序任务。

2000年6月，人类基因组工作草图绘制成功。基因工程研究的主要内容（六）应用研究供体细胞

目的基因

载体

重组DNA分子

转化细胞

受体细胞

多肽药物

疫苗、抗体

基因治疗

基因诊断

转基因动物

(畜牧业、渔业

生物反应器)

转基因植物

(农业、林业

生物反应器)

冶金、环保

轻工、食品

基因工程研究的主要内容●光合作用●固氮作用●转基因植物●转基因动物●产生次生代谢产物

（六）应用研究

1.基因工程与农业抗病虫提高品质提高花卉的观赏价值抗逆性基因工程研究的主要内容无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻基因工程研究的主要内容基因工程研究的主要内容转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯不会引起过敏的转基因大豆基因工程研究的主要内容生长快、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国)基因工程研究的主要内容乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)动物器官反应器：血液反应器和乳腺反应器基因工程研究的主要内容基因工程研究的主要内容导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠基因工程研究的主要内容

就基因药物而言，最理想的表达场所是

转基因动物的乳腺。

1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。

2）从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。

3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。基因工程研究的主要内容●纤维素的开发利用●酿酒工业●食品工业●制药工业●新型蛋白质的生产（六）应用研究

2.基因工程与工业基因工程研究的主要内容胰岛素100kg胰腺→4-5g胰岛素2000L培养液→

100g胰岛素！基因工程研究的主要内容

基因工程药品——生长激素治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从450L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。基因工程研究的主要内容

干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。

人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产基因工程药品——干扰素主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品时间国家用途上市时间国家人生长激素释放抑制素(SRM)1977日本巨人症人胰岛素1978美国糖尿病1982欧洲人生长激素（HGH）1979美国侏儒症1985美国人α-干扰素（IFN）1980美国病毒1985欧洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美国乙肝1986欧洲人白细胞介素1984美国肿瘤1989欧洲人促红细胞生成素（EPO）日本贫血1988欧洲人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美国人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）血栓症1987美国基因工程研究的主要内容（六）应用研究

3.基因工程与环境保护●环境监测●环境污染净化

4.基因工程与医学

●基因工程疫苗的研制与生产●基因诊断●基因治疗

基因工程研究的主要内容

基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。

1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来基因工程研究的主要内容

利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。基因工程研究的主要内容

基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。

通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。基因工程研究的主要内容基因工程研究的主要内容基因诊断

基因诊断：利用重组DNA技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷，因而比传统的诊断手段更加可靠。

基因探针技术：利用DNA碱基互补的原理，用已知的带有标记的DNA通过核酸杂交的方法检测未知的基因。基因工程研究的主要内容基因治疗（genetherapy）基因治疗：将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。基因治疗是21世纪的一大热点领域；被认为是征服肿瘤、心血管疾病、糖尿病尤其是遗传性疾病最有希望的手段。

通过研究“基因敲除”的耗子将帮助研究人类的癌症、糖尿病和高血压等慢性疾病与遗传的关系。

在猴子的未受精卵中加入附加基因，并利用它成功培育出健康活泼的小猴“安迪”。

通过对“安迪”的研究我们可以简单地引进如老年性痴呆病的基因、帕金森病基因等，加快针对这类疾病疫苗的开发研究。

基因工程研究的主要内容（七）基因工程在其他方面的应用

目前，基因工程在其他方面的应用也取得了令人振奋的成果。如日本科学家利用基因工程使家蚕丝心蛋白基因与绿色荧光蛋白基因相互融合，得到的家蚕蚕丝可发出绿色的光泽。人们利用花卉的花色基因改变花的颜色、利用花形基因改变花的形状、利用香味基因改变花的香味等等，以使我们的生活环境更加色彩斑斓。基因工程的意义与发展前景一、基因工程的意义●基因工程跨越生物种属间不可逾越鸿沟●基因工程技术缩短了进化时间●基因工程技术使人能对生物进行定向改造●基因工程技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。基因工程的意义与发展前景二、基因工程发展前景(一)基因本身也是一个产业

1.Rockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）

2.Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）

3.Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）基因工程的意义与发展前景(二)基因工程试剂的高回报

1.碱性成纤维细胞生长因子231元/ug2.红细胞生成素1072元/ug3.白细胞介素-2410元/ug4.巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug5.胰岛素10.2元/mg基因工程的意义与发展前景基因工程不是发现，而是创造。本章重点掌握的内容及作业题本章重点掌握的内容◆基因工程的概念及基本技术路线◆了解基因工程的发展简史及其意义作业题◆预习第二章“基因工程的酶学基础”并写出每章内容的课程总结（处绪论外）。不同基因具有相同的物质基础

在原则上，所有生物的DNA都是可以重组互换的，因为地球上的一切生物，无论是高等还是低等，他们的基因都是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片断，而所有生物的DNA结构都是一样的。有些病毒的基因定位在RNA上，但这些病毒RNA可以通过反转录产生cDNA，并不