项目九高效液相色谱法2

项目九高效液相色谱法一.高效液相色谱法（HPLC）概念？

指以液体为流动相的色谱技术法高压泵化学键合固定相高灵敏用检测器二.高效液相色谱法的特点？1、分离效能高2、选择性高3、分析速度快4、检测灵敏度高三、HPLC与GC的区别？三、HPLC与GC的区别1．分析对象的不同2．流动相的区别3．操作条件的差别流程及主要部件

HPLC主要有高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录仪组成仪器分析一高压输液系统1.贮液器溶剂使用前必须过滤脱气2.高压输液泵泵有恒流泵和恒压泵两类往复式柱塞泵（恒流泵）电动机偏心轮柱塞柱球形单向阀溶剂3.梯度洗提装置梯度洗脱：分离过程中，通过改变流动相组成来增加洗脱能力的一种方法通过梯度装置可得两种或三种、四种溶剂按一定比例混合进行二元三元或四元梯度洗脱高压梯度（内梯度）：将溶剂用高压泵增压后输入色谱系统的梯度混合室，加以混合后送入色谱柱。低压梯度（外梯度）：在常压下预先按一定程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱ABABCC仪器分析二进样系统1.注射器进样

1—10μL微量注射器，类似于气相色谱进样针，只是其针头为平头。仪器分析3.高压定量进样阀（六通阀）

仪器分析三分离系统

色谱柱为直型不锈钢柱，内径4.6或2mm，柱长15～30cm。四检测系统专用型：紫外吸收检测器（UVD紫外吸收检测器五记录系统色谱工作站第三节高效液相色谱法的分类及分离原理按固定相分类按分离机理分类液液色谱法LLC液固色谱法LSC分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法分子排阻色谱法化学键合色谱法亲合色谱法胶束色谱法HPLC一液液分配色谱法

固定相与流动相均为液体（互不相溶）

基本原理：试样溶于流动相后，在色谱柱内经过两相分界面进入固定液中。由于试样组分在固定相和流动相中的溶解度存在差异，因而组分在两者间进行分配液一液分配色谱法与气一液色谱法的比较

相似处：分离顺序决定于分配系数的大小，K大的组分保留值大

不同处:

GC流动相性质对K影响不大，而LC中流动相种类对K影响较大正相色谱——固定液极性>流动相极性

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出峰;

适于分离极性组分

反相色谱——固定液极性<流动相极性

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出峰;

适于分离非极性组分固定相：早期涂渍固定液，系统内部压力大，固定液易流失，不实用，故较少采用；

化学键合固定相：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面。C-18柱（反相柱）化学键合固定相：将具有官能团的固定相键合到载体表面，构成化学键合相化学键合色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合色谱法硅胶表面十八烷基硅烷键合相ODS化学键合固定相特点

不易流失

热稳定性好

化学性能好

载样量大

适于梯度洗脱应用适用于极性较小的样品分离。可以分离同系物、复杂稠环芳烃以及药物、激素、天然产物、农药残留量的测定在高效液相色谱法作为分离方法中，有80%的物质的分离依靠反相色谱来完成。在反相色谱中，C18是常用的填充载体，水是常用的流动相弱组分，重要的是选择流动相的强组分，常用的强组分有甲醇、乙腈与四氢呋喃稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC

柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器应用举例二液固吸附色谱分离原理以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。利用各组分在固定相上吸附能力的不同将它们分离吸附脱附再吸附再脱附

…分离过程是一个吸附－脱附的平衡过程液固吸附色谱法分离机理固定相

极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等

非极性固定相：活性炭、聚合物小球等

较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂流动相各种不同极性的一元或多元溶剂,常用的有甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等出柱顺序强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱应用中等分子量的油溶性样品如油品、脂肪、芳烃等不同极性取代基的化合物结构异构体和几何异构体混合物的分离环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37～50m)

流动相：正己烷流速：1.5mL/min

色谱柱：50cm2.5mm(内径)

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析三凝胶色谱（尺寸排阻色谱）固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)分离原理：按分子尺寸大小差异进行分离当被测组分随流动相通过凝胶色谱柱时:①

尺寸大于孔径的组分分子不能渗入凝胶孔隙而被全部排斥，最先流出色谱柱②尺寸小于孔径的分子则全部渗入凝胶孔隙，最后流出③尺寸中等分子部分渗入较大孔隙，而排斥较小孔隙。因此介于中间流出分离原理示意图排阻色谱分离示意图相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离相对分子质量V0ViA排斥B全渗透选择渗透V0ViVt洗脱体积固定相三种:软质凝胶半硬质凝胶硬质凝胶流动相：仅作为载体，不与试样本身或填料有任何相互作用；且完全溶解试样、在分离温度下黏度低度，其沸点通常比柱温高20~50℃，与检测器匹配等应用

主要用于高分子化合物的分子量及分子量分布测定和高分子杂质测定

2005-10版药典大量收载该法1.聚乙二醇400002.聚乙二醇100003.聚乙二醇30004.聚乙二醇10005.聚乙二醇四、离子交换色谱(IEC)基本原理：根据不同组分离子对固定离子基团的亲和力的差别而达到分离目的。组分在固定相上发生的反复离子交换反应；亲和力大，保留时间长固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用主要用来分离离子或可离解的化合物，不仅应用于无机离子的分离如稀土化合物。还用于有机物分离（分离氨基酸、核酸、蛋白质等）离子交换色谱法油田水质中的阴离子分析固定相：薄壳型阴离子交换树脂(3×250mm)流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3第四节高效液相色谱

法的应用(P244)第五节高效液相色谱分离方法的选择一、选择合适的液相色谱分离类型

了解分析对象要分析的组分的大致浓度干扰物质试样的性质结构分子量酸碱性溶解性二、选择合适的分析条件色谱柱流动相检测器的种类及条件（波长等）