附加1微卫星和性别鉴定

微卫星引物开发及RAPD分子标记鉴别植物性别一、微卫星引物开发简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)由1-5个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列,重复数为10~20次含有串联重复的核心序列两侧较保守的侧翼序列

动物体中以双核苷酸(CA/GT)n最为常见。植物基因组中(AT)n最为常见，其次是(GA)n和(CA)n1、微卫星定义微卫星重复序列区非重复特异序列区相关文献近源种的引物数据库搜寻法（NCBI等）根据所研究类群的基因文库中筛选（目前常用的是磁珠富集法）很多物种没有完成全基因组测序，进行SSR研究的时候需要开发引物。一、微卫星引物开发1、从数据库中挖掘微卫星序列一、微卫星引物开发从NCBI网站中搜索黄连木属植物的表达序列标签（EST）核酸序列PCR扩增并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测利用primer5.0软件进行引物设计利用SSRHunter1.3软件进行微卫星序列片段的查找EST序列的聚类和拼接，去掉可信度较低的序列片段一、微卫星引物开发一、微卫星引物开发2、磁珠富集法—FLASCO法（FastisolationbyAFLPofSequencesContainingrepeats）基本原理：首先用带有生物素标记的探针并与基因组DNA酶切片段杂交,再利用生物素与链亲和素亲和性强的特性,用包被链亲和素的磁珠进行磁力吸附完成重复序列目标片段的富集,进行PCR扩增,连接转化,阳性克隆测序,从而获得含有SSR重复序列的一种方法。植物基因组DNA的制备浓度验证微卫星分离酶切基因组DNA目的片段的回收（回收片段大小）目的片段和人工接头的连接和扩增纯化磁珠杂交富集（生物素探针标记）克隆微卫星文库、筛选阳性克隆构建微卫星文库从微卫星富集文库中筛选微卫星测序序列分析及引物设计2、FLASCO法开发微卫星引物一、微卫星引物开发（1）DNA抽提

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CTAB方法，一般利用试剂盒。（2）酶切连接

—MseI+T4Ligase（3）AFLP特异扩增DNA片段

—酶切连接液为模板

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MesI–N引物（4）探针杂交

-5，端生物素修饰的重复碱基探针与扩增产物杂交（5）磁珠洗脱

—磁珠特异性吸附杂交片段，洗脱除去未杂交片段2、FLASCO法开发微卫星引物一、微卫星引物开发（6）双链恢复

-磁珠富集得到的目的单链以MesI-N为引物特异扩增恢复为双链（7）质粒连接

-PMD18-Tvector（8）转化克隆

-DH5-α感受态细胞涂板，37℃培养11-13h（9）单克隆扩增培养

-挑取白色饱满菌落液体培养基培养5h

（10）菌落PCR选择目标克隆

-三引物法扩增产物为双带2、FLASCO法开发微卫星引物一、微卫星引物开发（11）测序

-目标克隆菌液测序（12）引物设计及优化

-CID软件分析序列及设计引物

-引物扩增条件优化（13）荧光PCR及基因分型

-荧光修饰引物特异扩增

-基因分型（14）数据分析

-Genescan读取基因分型数据

-位点多态性信息

-位点是否偏离哈温平衡

-位点是否连锁不平衡2、FLASCO法开发微卫星引物一、微卫星引物开发2、FLASCO法开发微卫星引物一、微卫星引物开发二、RAPD鉴定植物性别RAPD标记是采用人工合成的10个碱基的寡核苷酸作为随机引物,以基因组DNA为模板,通过较低的温度条件下的PCR技术获得特异性的序列长度约为200-3000个碱基序列,然后就可能将合成的新链作为下一次合成的模板，从而转化成序列特异扩增区域，获得特异引物，达到鉴定的目的。5’3’3’5’5’5’1、RAPD分子标记技术2、RAPD分子标记鉴定植物性别试验流程雌雄基因池的构建（BSA）随机引物筛选（文献＋目录）RAPD扩增RAPD特异片段的回收与克隆阳性克隆进行测序SCAR特异引物的设计、合成SCAR引物的验证二、RAPD鉴定植物性别Primer类型SequenceOPO08RAPDCCTCCAGTGTBC1200RAPDGCCTGATTGCS1RAPDGTTTCGCTCCS281RAPDGTGGCATCTCS218RAPDGATGCCAGACS263RAPDGTCCGGAGTGS281-1S281-2SCAR5'-CCTGGTTGCTTGTGTTGATTAG-3'5'-GAGTGTCATCAAGCCATCTGTC-3'二、RAPD鉴定植物性别表2.1RAPD分子标记中随机引物和特异性引物试验号TaqDNApolymerase(U)Primer(µmol.L-1)dNTPs(mmol.L-1)Mg2+(mmol.L-1)DNA模板ng/µL-110.50.250.253.01.520.750.350.152.51.531.00.350.253.52.041.250.250.152.02.050.50.30.153.52.560.750.20.252.02.571.00.20.153.01.081.250.350.252.51.090.50.20.32.52.0100.750.350.23.02.0111.00.350.32.01.5121.250.20.23.51.513