第二章分子荧光光谱法(去磷光)

1第二章分子荧光光谱法MolecularFluorescenceSpectrometry2

分子荧光光谱是一种发射光谱分析方法。分子荧光光谱法

分子吸收能量后，从基态跃迁到激发态。激发态通常是不稳定的，会释放能量而产生跃迁回到基态，如果是以光辐射的形式释放能量，就称为发光。相应的光谱分析法就称为分子发射光谱法。分子荧光是一种光致发光过程。日本富山海边的荧光乌贼用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画

荧光棒4分子荧光光谱法2.1分子荧光的产生过程2.2荧光的激发光谱和发射光谱2.3影响荧光强度的因素2.4分子荧光光谱仪2.5分子荧光光谱法的应用5

由分子结构理论，主要讨论荧光的产生机理。1.分子能级与跃迁

分子能级的每个电子能级上，都存在振动、转动能级；

2.1分子荧光的产生过程基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；62.电子激发态的多重度2.1分子荧光的产生过程单重态：与基态中的电子自旋方向相反，寿命较短.三重态：与基态中的电子自旋方向相同，寿命较长7

基态——S0第一、第二、…电子激发单重态

——S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态

——T1、T2…

；2.1分子荧光的产生过程8

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量的过程；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁2.1分子荧光的产生过程2.分子的去激发过程9S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫2.1分子荧光的产生过程103.分子的去激发形式2.1分子荧光的产生过程振动驰豫

同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至相邻低振动能级间的跃迁。

发生振动弛豫的时间10-12

S

。

见Jablonski能级图113.分子的去激发过程2.1分子荧光的产生过程内转换

同多重度电子能级中（如S2→S1，T2→T1）,等能级间的无辐射能级交换。

见Jablonski能级图内转换发生的时间约在10-12

S。

通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。123.分子的去激发过程2.1分子荧光的产生过程外转换

激发态分子与溶剂和其他溶质分子间的相互作用及能量转移的非辐射跃迁。外转换使发光强度减弱或消失，这种现象称为“猝灭”或“熄灭”。

见Jablonski能级图133.分子的去激发过程系间跨跃不同多重态之间如（S1→T1）的一种无辐射跃迁。见Jablonski能级图该过程是激发态电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。即单重态到三重态的跃迁。当两种能态的振动能级重迭时，这种跃迁的几率增大。

即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。

2.1分子荧光的产生过程143.分子的去激发过程荧光发射

激发态分子由第一激发单重态的最低振动能级S1回到基态S0伴随的光辐射称为荧光。荧光发射是相同多重态间的跃迁，几率较大，速度很快，10-7～10-9s,见Jablonski能级图S04321S143212.1分子荧光的产生过程153.分子的去激发过程磷光发射激发态分子从第一激发三重态（T1）的最低振动能级上返回基态S0伴随的光辐射称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁（即T1→S0）。故属于“禁阻”跃迁，因此磷光的辐射速度远远小于荧光，约为10-4到10-5s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可观察到后发光现象。而荧光发射却观察不到该现象。

见Jablonski能级图2.1分子荧光的产生过程16荧光激发光谱，简称激发光谱，测量化合物发射的某一固定波长的荧光的强度（选最大发射波长）与激发光波长的关系曲线；1.荧光激发光谱和发射光谱曲线在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。

激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。2.2荧光的激发光谱和发射光谱17激发光谱固定em=620nm(MAX)ex=290nm

(MAX)固定发射波长(em)

扫描激发波长(ex)荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似2.2荧光的激发光谱和发射光谱18B.荧光发射光谱，又称荧光光谱,固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线。2.2荧光的激发光谱和发射光谱发射光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子荧光的相对发射强度。19ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)发射光谱(荧光光谱)发射光谱的形状与激发波长无关2.2荧光的激发光谱和发射光谱固定激发波长(ex)扫描发射波长(em)

20212.2荧光的激发光谱和发射光谱

在溶液中，荧光光谱显示了某些普遍的特征。为我们识别荧光物质的正常荧光提供了基本原则。3.荧光光谱的特征(1).Stokes位移

在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的激发波长长。这种波长位移现象是1852年Stokes首次观察到的。222.2荧光的激发光谱和发射光谱

荧光总是从最低激发单重态回到基态时所发射的辐射，而激发过程有可能将分子激发到高的振动能级或更高的电子能级上去。

振动、热辐射等使分子失去能量。即激发与发射荧光间的能量损失是斯托克斯位移产生的主要原因。

其他如溶剂效应、激发态分子的反应也会引起斯托克斯位移。232.2荧光的激发光谱和发射光谱3.荧光光谱的特征

(2).发射光谱不变形

或者说荧光发射光谱的形状与激发波长无关。

一般地，用不同激发波长激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。

这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程后，最终回到第一激发态的最低振动能级。

24S04321S14321

分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上（S1→S0）。

所以荧光光谱的形状与激发波长无关。2.2荧光的激发光谱和发射光谱252.2荧光的激发光谱和发射光谱(3).镜像对称规则

分子的荧光发射光谱与其激发光谱之间存在着镜像关系。激发光谱发射光谱262.2荧光的激发光谱和发射光谱

镜像对称规则的产生，是由于:

大多激发光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，

而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构。

S04321S1432127S04321S14321

一般情况下，分子的基态和第一激发单线态的振动能级结构类似，因此激发光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。2.2荧光的激发光谱和发射光谱28292.3影响荧光强度的因素分子产生荧光必须具备两个条件：①分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；②吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。302.3.1荧光量子产率荧光量子产率：

也称为荧光效率或量子效率，表示物质发射荧光的能力。

可以定义为物质吸光后发射的荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比值。31

返回基态速率强荧光物质：荧光发射>无辐射跃迁大

低荧光物质：无辐射跃迁>发射荧光小

因此，荧光量子效率与荧光发射过程的速率及无辐射过程的速率有关。2.3.1荧光量子产率32

式中，kf

是荧光发射过程的速度常数，

ki

是系间跨跃和外转换等有关无辐射跃迁过程的速率常数。

一般而言，

kf

主要取决于分子的化学结构，而ki

主要取决于化学环境。

分子结构

发光分子所处的环境因此，影响物质荧光强度的因素主要有两个：2.3.1荧光量子产率332.3.2影响荧光强度的因素

一般地，具有强荧光的分子都具有大的共轭π键结构，同时，给电子取代基，刚性的平面结构均有利于荧光的发射。

因此:分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键

的有机化合物才容易发射荧光;

饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著

的荧光。

1.分子结构342.3.2影响荧光强度的因素(1)共轭效应

产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少。352.3.2影响荧光强度的因素(2)结构刚性效应

可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。

实验表明，具有刚性结构的分子容易产生荧光。若荧光染料吸附在固体表面上，由于固体表面提供的附加刚性，也会使荧光增强。荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质2.3.2影响荧光强度的因素372.3.2影响荧光强度的因素芴联苯f=1.0f=0.21，2-二苯乙烯反式：平面构型

强荧光体顺式：非平面构型非荧光体382.3.2影响荧光强度的因素

此外，分子的这种平面刚性结构效应对许多金属配合物的荧光发射也有影响。

如:

8-羟基喹啉本身的荧光强度远比其金属配合物低。

利用这种性质可进行痕量金属离子的测定。392.3.2影响荧光强度的因素(3)取代基效应给电子基团，如

-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3和

-N（CH3）2等，使荧光增强；原因：产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。402.3.2影响荧光强度的因素(3)取代基效应

吸电子基团，如

-Cl、-Br、-I、-NHCOCH3、-NO2和

-COOH等，使荧光减弱。

原因：n→π*跃迁的摩尔吸光系数、量子产率均低于π→π*跃迁。π→π*跃迁是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。41小结：强荧光的有机化合物具备下特征:①大的共轭π键结构；②刚性的平面结构；③取代基团为给电子取代基。2.3.2影响荧光强度的因素422.3.2影响荧光强度的因素

(1)

溶剂效应

溶剂对荧光光谱的影响主要是由于溶液的介电常数和折射率等因素的作用，这称为一般溶剂效应，这种效应是普遍存在的。

除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；

增大溶剂的极性，光谱红移。这是由于π→π＊跃迁的能量减小，从而使荧光光谱向长波方向移动。2.环境因素432.3.2影响荧光强度的因素

(2)

温度的影响

一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。原因：温度降低，介质的粘度增大，溶剂的驰豫作用大大减小。温度升高，碰撞频率增加，外转换的去激发几率增加。

因此，选择低温条件下进行荧光检测将有利于提高分析的灵敏度。442.3.2影响荧光强度的因素(3)

pH的影响

对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的影响。

因此在荧光测量中往往需要控制溶液的pH值。pH<5无荧光5~12蓝色荧光>12无荧光

苯胺阳离子

苯胺分子

苯胺阴离子自吸收现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；(4)内滤光作用和自吸收现象200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱2.3.2影响荧光强度的因素462.3.2影响荧光强度的因素

(5)

散射光的影响

瑞利(Reyleigh)散射光—光子和物质分子碰撞时，未发生能量交换，仅运动方向发生改变，波长与入射光波长相近，由溶剂、容器、胶体等散射引起

—选择适当的波长，由单色器消除溶剂的拉曼（Raman）光散射—光子和物质分子碰撞时，运动方向发生改变，同时发生能量交换，波长与荧光波长相近，随激发光改变而改变，由空白溶剂产生。

—采用波长较短的激发光可避免干扰。

472.3.2影响荧光强度的因素

(6)

荧光猝灭

荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互作用，使荧光强度减弱的作用称为荧光猝灭。包括碰撞猝灭、氧的猝灭、浓度（自）猝灭和自吸收等。

能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。

氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。

482.4分子荧光光谱仪荧光光谱仪是由光源，激发单色器，样品池，发射单色器，检测器及记录系统等组成。光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器492.4分子荧光光谱仪

光源发出的光经激发单色器分光后得到特定波长激发光，入射到样品使荧光物质激发产生荧光，通常在90度方向上进行荧光测量。光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器

发射单色器与激发单色器互成直角。经发射单色器分光后使荧光达到检测器而被检测。50荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制发射单色器2.4分子荧光光谱仪51紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器2.4分子荧光光谱仪52二.光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.4分子荧光光谱仪53常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源2.4分子荧光光谱仪54三.单色器激发单色器

用于荧光激发光谱的扫描及选择激发波长；发射单色器

用于扫描荧光发射光谱及分离荧光发射波长。2.4分子荧光光谱仪55五.样品池问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？四.检测器光电倍增管电荷偶合元件检测器

2.4分子荧光光谱仪56紫外-可见分光光度计

测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p1.材料：紫外-可见分光光度计——石英池、玻璃池荧光分光光度计——石英池

2.形状：紫外-可见分光光度计的吸收池——两面透光荧光分光光度计的样品池——四面透光572.5分子荧光光谱法的应用

分子荧光光谱法具有高的灵敏度和好的选择性。

荧光分析法的应用广泛，可测定60余种元素，尤其适合对生物大分子的检测。

此外，还可作为高效液相色谱及毛细管电泳的检测器。荧光探针金属-有机配合物（MOF）发光材料分子传感器物质的检测稀土掺杂发光材料发光器件光谱592.5分子荧光光谱法的应用（1）荧光强度与浓度的基本关系式1.荧光定量分析光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：P13960荧光强度（IF）与吸收的激发光的光强及量子产率成正比：按照级数展开式：2.5分子荧光光谱法的应用61对于稀溶液，当bc<0.02时：IF----荧光强度F-----荧光量子产率b--吸收光程--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度当I0一定时，2.5分子荧光光谱法的应用62

低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原因，荧光强度与物质的浓度不呈线性关系2.5分子荧光光谱法的应用

与紫外－可见分光光度法相比，其灵敏度可高出2－4个数量级，其检测下限通常可达0.1～0.001

gcm-3。

原因？632.5分子荧光光谱法的应用（2）单组分的荧光测定直接测定法：适用于有荧光的物质间接测定法：适用于不发生荧光，或荧光量子效率很低物质。利用化学反应使非荧光物质转变为荧光物质；例：甾族化合物，经浓H2SO4处理后，使不产生荧光的环状醇类结构改变为能产生荧光的酚类结构。荧光猝灭法，若被测物质具有荧光猝灭剂的作用，可测量荧光强度的降低来测定该荧光物质的浓度。例：硼砂对姜黄素的荧光强度有显著的淬灭作用，可用于测定食品中的硼砂。

642.5分子荧光光谱法的应用无机化合物

金属离子与有机试剂形成荧光配合物后；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定652.5分子荧光光谱法的应用几种常用的荧光试剂试剂测定的元素安息香B,Zn,Ge,Si2,2’-二羟基偶氮苯Al,F,Mg2-羟基-3-萘甲酸Al,Be8-羟基喹啉Al,Be有机化合物脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃——荧光分析法是最主要的测定方法。为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等。例：3，4–

苯并芘为强致癌物质煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生3，4–

苯并芘，汽车尾气也是主要来源食品加工过程也会产生3，4–

苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品分析测定：用环己烷将3，4–

苯并芘从试样中提取出来，用碱将提取液的脂肪类物质皂化，然后用色谱法分离纯化，用95%C2H5OH稀释，用荧光分光光度计测定相对荧光强度进行定量——又称核黄素，是一种生长促进剂，常存在于动物肝脏、肉类、蛋黄、豆类、花生、蘑菇和海藻中，VB2易溶于强酸或强碱性溶液。在低浓度情况下，I=KC，I与C呈线性关系，在pH6~7荧光最强在430~440nm蓝光照射下，发出绿色荧光，em=535nm下测I，用标准曲线法测定维生素B2待测物试剂λexmaxλemmax测定范围ppm丙三醇苯胺紫外蓝色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50维生素A无水乙醇3454900~20蛋白质曙红丫紫外5400.06~6肾上腺素乙二胺4205250.001~0.02

青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺邻苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-4702.5分子荧光光谱法的应用（2）单组分的荧光测定

定量方法可采用标准曲线法。

首先测定一系列的标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度标准曲线，再测量试样的荧光强度，从而求得其浓度。1.荧光定量分析712.5分子荧光光谱法的应用（3）多组分的荧光测定

利用荧光物质本身具有的荧光激发光谱和发射光谱，实验时可以选择任一波长来进行多组分的荧光测定。

若二组分的荧光光谱峰不重叠，可选用不同的发射波长来测定各组分的荧光强度；

若二组分的荧光光谱峰相近，甚至重叠，而激发光谱有明显差别，这时可选用不同的激发波长来进行测定。Al3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=365nm

em=520nmGa3+—8-羟基喹啉配合物的氯仿溶液

ex=436nmem=520nm