第一章绪论课件

酶学和生物催化第一章绪论第一节生物催化和工业生物技术第二节研究内容第三节国内外酶制剂工业概况生物学化学工程工程学化学生物工程生物化学生物技术第一节生物催化新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生生物技术医药生物技术农业生物技术工业生物技术环境生物技术材料生物技术

...用生物或生物分子机器生产产品和解决问题生物技术的具体应用背景：工业生物技术的出现在19—20世纪，人类的化学工业文明取得了辉煌成就，其主要特征是以化石资源为物质基础。化石资源是储量有限的不可再生资源，正走向衰竭。据估计，可开采石油储量仅可供人类使用约50年，天然气约75年，煤炭200—300年。进入21世纪，面临化石资源不断枯竭、环境污染日益加剧的严重局面，转向以可再生生物资源为原料，可再生生物能源为能源，环境友好、过程高效的新一代物质加工模式是必然趋势，这种加工模式的核心技术就是工业生物技术(Industrialbiotechnology)。

20世纪后半叶，分子生物学的突破性成就引发了现代生物技术发展的三次浪潮。第一次浪潮主要体现在医药生物技术(也称为红色生物技术，Redbiotechnology)领域，其标志是1982年重组人胰岛素上市。第二次浪潮发生在农业生物技术(也称为绿色生物技术，Greenbiotechnology)领域，其标志为1996年转基因大豆、玉米和油菜相继上市。以2000年聚乳酸上市为标志的工业生物技术(也称为白色生物技术，Whitebiotechnology)已成为生物技术发展的第三次浪潮，推动着一个以生物催化和生物转化为特征，以生物能源、生物材料、生物化工、生物冶金等为代表的现代工业体系的形成，在全球范围内掀起了一场新的现代工业技术革命。2003年，白色生物技术已影响全球5%的化学品市场(约500亿美元的市场值)。据有关专家预测，至2015年，全世界的化工行业将有1/6的产值源自白色生物技术，金额高达3050亿美元。生物技术产业化的三个浪潮

医药生物技术:

1982年重组人胰岛素上市农业生物技术:

1996年转基因大豆、玉米、油菜相继上市工业生物技术:

世纪之交聚交酯、生物钢、聚乳酸相继上市工业生物技术---迈向发达国家之战略

什么是工业生物技术？以微生物或酶为催化剂进行物质转化，大规模地生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等产品的生物技术。它是人类由化石(碳氢化合物)经济向生物(碳水化合物)经济过渡的必要工具，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。生物技术在工业上的应用主要分为两类，一是以可再生资源(生物资源)替代化石燃料资源；二是利用生物体系如全细胞或酶为反应剂或催化剂的生物加工工艺替代传统的、非生物加工工艺。

工业生物技术的核心工业生物技术的核心是生物催化(Biocatalysis)。由生物催化剂完成的生物催化过程具有催化效率高、专一性强、反应条件温和、环境友好等优势。美国能源部、商业部等部门预测：生物催化剂将成为21世纪化学工业可持续发展的必要工具，生物催化技术的应用可在未来的20年中使传统化学工业原材料、水和能源消耗减少30%、污染物排放减少30%。世界经合组织(OECD)指出：“工业生物技术是工业可持续发展最有希望的技术”[工业生物技术&生物催化含意：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化工业生物技术是生物技术的重要组成部分2001年，OECD在一些国家和地区进行了生物技术用于改造传统工业的21个试验。试验主要是测试生物技术对传统重污染工业的绿色改造效率：在改造纸浆和造纸行业方面，生物技术能减少漂白过程中10%—15%的氯排放量，并且将漂白过程中的能量消耗降低40%；在改造纺织业方面，生物技术可以减少14%—18%的水消耗量，与用水有关和空气散热方面的费用减少50%—60%，漂白过程的能源消耗也将降低9%—14%；塑料产品生产在改造方面，用生物有机原料替代石化原料，能够减少20%—80%的对石化资源的需求，而且产品是可自然降解的“绿色塑料”；生物技术用于化学制药行业，例如维生素B2的生产过程中，能够减少80%的CO2排放量，减少67%的污水排放量。将生物技术用于头孢类抗生素的生产，能够减少50%的CO2排放量，节约20%的能源消耗，节水75%。中国高度重视工业生物技术的发展，2005年9月，由国家科技部中国生物技术发展中心组织了“首届国际生物经济高层论坛”在北京召开。在2006年颁布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要》中把“新一代工业生物技术”作为“前沿技术”列入规划。工业生物催化和生物转化的研究，是中国参与生物技术国际竞争的一个难得的机遇和切入点，也是我国生物技术应用研究的一个战略重点，其最终目标是通过生物学、化学和过程科学的交叉，建立以生物催化和生物转化为基础的新生物加工体系。国际工业生物技术的研究热点和未来趋势当前生物催化和转化技术具代表性的研究热点包括以酶法生产甜味剂阿斯巴甜、L-苯丙酸、抗菌素中间体6-APA、D-对羟苯甘氨酸和1,3-丙二醇等。作为生物材料的代表产品聚乳酸，目前已有多家公司大规模生产。2000年全球以生物法生产的可再生的生物能源——液体燃料已近1000万吨。1.工业生物催化剂改性和提高

生物催化剂是生物催化和转化技术的核心。生物催化剂快速定向改造新技术已被用于上百个酶的进化，大大提高了生物酶的活性和效率。如枯草杆菌蛋白酶E在有机溶液中(60%DMF)的活性提高了170倍；今后生物催化剂的研发与改进需要追求如下目标：性能更好(包括选择性、热稳定性、溶剂耐受性等)、催化范围更广、催化功能更多、催化速度更快、生产成本更低。这些目标可具体量化为：酶的温度稳定性提高到120℃—130℃、酶活性比现有的在水或有机溶剂中其活性增加100—10000倍、产率提高10—100倍、酶转化率达到现有化学催化剂的水平；耐久性达到几个月至几年；提高了固定化酶或微生物的活性。近年来，这方面的研究工作主要集中在极端微生物、未培养微生物、共生微生物、非水相催化、分子定向进化、合理化设计等。

1.1极端微生物极端微生物的研究和应用已成为国际热点，高温DNA聚合酶、碱性酶、碱性纤维素酶、环糊精酶及极端采油菌已在产业上产生了重要影响。极端微生物研究涉及嗜高温菌、嗜低温菌、嗜盐菌、嗜极端pH菌等。嗜高温菌主要应用于食品工业和洗涤剂工业；嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量；嗜盐菌由于在高盐浓度下稳定而被用于含盐体系催化剂。现已筛选出30多属中的70多种嗜高温菌。最近的研究集中在与工业生物催化相关的极端酶的认定上，这些酶包括：酯酶/脂肪酶、糖苷酶、醛缩酶、腈水解酶/酰胺酶、膦酸酯酶、消旋酶等。

1.2非水相酶催化

非水相酶催化反应对一些传统化学催化困难的过程具有重要意义。通过改变溶剂和相条件，可以得到不同空间结构和光学特性的聚合物。尽管非水相体系有诸多优点，但是酶在有机相中由于分子间键能的变化，容易发生结构重排而失活。为了提高酶活性和使用寿命，可采用化学修饰、表面改性、固定化等多种方法，业已取得显著的成果。1.3催化剂改造的方法学

自然界的酶都是在自然生理条件下进化而来的，当其应用到条件迥然不同的非生理条件下的工业制造过程中，往往稳定性、活性或溶液的兼容性差，因此必须对生物催化剂进行适当改造以适应实际工程的需要。酶的改进技术主要集中于以下两种方法：(1)基于酶结构和催化机理的理性分子设计；(2)基于随机突变、DNA重排等技术的定向进化，如：易错PCR(Error-pronePCR)和DNA改组(DNAshuffling)技术[7]。

2功能基因组学与代谢工程

代谢工程是在对细胞(包括微生物、植物、动物乃至人体细胞)内代谢途径网络系统分析的基础上，进行定向的、有目的地改变，以更好地理解和利用细胞代谢进行化学转化、能量传递和超分子组装。代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞[8]。代谢工程的核心与功能基因组密切相关。通过对不同细胞菌体进行遗传改变并观察识别所产生的生理响应，代谢工程工作者取得经验并能找出基因组?蛳生理学(或基因型?蛳表型)之间的关系，从而进一步开展代谢工程研究。根据功能基因组(转录物组、蛋白质组及代谢物组)信息，可以进行代谢网络重建、优化及设计，进而通过代谢工程改进细胞菌体性能[9]。3系统生物学

随着后基因组时代的到来，“系统生物学”这一学科的重要作用受到特别强调。根据系统生物学原理，充分利用不断增加的基因组(序列)数据及生物信息学工具，有机结合转录组学、蛋白质组学，特别是代谢物组学进行代谢工程研究，结合生物信息学和计算生物学的研究，达到改造和控制细胞性质、提高底物利用及产品收率、促进工业生物技术发展的目的。

4未来发展趋势的特点

世界各国在工业生物技术研发领域，不仅制定了近期及长远的发展规划，还在政策和资金上给予资助。目前工业生物技术的发展趋势有以下特点：

(1)传统的以石油为原料的化学工业发生变化，向条件温和、以可再生资源为原料的生物加工过程转移；

(2)利用生物技术生产有特殊功能、性能、用途或环境友好的化工新材料，特别是利用生物技术可生产一些用化学方法无法生产或生产成本高以及对环境产生不良影响的新型材料，如丙烯酰胺、壳聚糖等；

(3)利用生物生产工艺取代传统工艺，如生物可降解高分子的生产；

(4)传统的发酵工业已由基因重组菌种取代或改良；

(5)生物催化成为化工产品合成的支柱。

国外主要工业生物技术领域的研发现状

目前，国际范围内的工业生物技术研究开发领域主要集中于生物能源、生物材料和其它生物基产品三大方面。1生物能源(Bioenergy)

生物能源主要包括生物乙醇、生物柴油、沼气、生物制氢等。为保障石油安全，美国、加拿大、欧盟、日本等国家在生物燃油的政策扶植和研发投入方面比较领先，取得了显著的社会效益和经济效益。2生物材料(Biomaterial)

广义的生物材料可以理解为一切与生物体相关的应用性材料或由生物体合成的材料。按其应用可分为生物工程材料、生物医用材料和其它生物材料。而按生物材料来源可分为天然生物材料和人工生物材料，有些材料兼具天然和人工合成的特性。狭义的生物材料指生物医用材料，即能够用来制作各种人工器官和制造与人工生理环境相接触的医疗用具和制品的材料。

目前，由生物合成的聚乳酸(PLA)和聚羟基脂肪酸酯(PHA)是生物材料的典型代表，因其良好的性能及同时兼具生物工程材料和生物医用材料应用特性而成为近年来研究最活跃的两种生物材料。3其它生物基产品(bio-basedproducts)

目前，以生物质为原料，运用生物质炼制技术(Biomassrefinery)进行生物加工，可生产大宗化学品、精细化学品、医药中间体和各种清洁能源等，其中包括酶、香料、化妆品、润滑剂、抗生素、杀虫剂、植物生长催化剂、氨基酸、维生素、抗氧化剂以及其它化学制品等。

我国工业生物技术发展现状及思考

中国工业生物技术是国际上发展较早、产业规模最大的领域之一。在微生物资源、基因组学、蛋白质组学、代谢工程、酶蛋白分子进化等研究领域呈现出快速成长的良好势头。产业技术水平与产品产量也呈快速增长趋势，如丙稀酰胺、谷氨酸、柠檬酸、维生素C、青霉素等产品的产量已进入世界的前例；又如丙稀酰胺、维生素C、1,6-二磷酸-果糖、黄原胶、L-苹果酸等产品的技术水平已达国际先进或领先；在生物能源方面也取得了较大的进展，如目前我国酒精产量为300多万吨，仅次于巴西、美国列世界第三。但是我国生物技术的研究和产业技术总体水平与世界先进水平仍有较大的差距，国外代谢工程菌的工业化成功例子虽然不多，但在我国尚无一例代谢工程菌株进入中试试验。由于国外已积累了较丰富的构建及使用代谢工程菌株的经验，未来5年内预期将会有一批产品至少在中试规模用工程菌生产。我国相关大学和研究机构虽已开展了一些微生物功能基因组、代谢工程等的研究，但大多数研究仍停留在前期的单基因操作阶段，而生物能源、生物材料和精细化学品的生物制造的研究和技术水平落后于发达国家。无论是原始创新的基础研究，还是技术创新性研究，整体水平都落后于发达国家，因此急需加强与工业生物技术相关的应用基础和技术开发的研究。

工业生物技术发展空间提升传统产业生物能源环境生物技术生物材料底物生物反应器检测控制仪表培养基（灭菌）经加工原料酶细胞生物催化剂（游离或固定化）机械能除菌空气产品提取纯化副产品产品废物热能原材料营养物典型工业生物技术过程核心技术？生物催化（Biocatalysis)利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。生物转化（Biotransformation)生物催化化学工业发酵工业轻工业采矿医药食品能源材料生物安全环境生物催化是工业生物技术的核心技术以生物催化法合成的主要产品

产品名称产量丙烯酰胺10万吨/年聚乳酸1.3万吨/年阿斯巴甜2万吨/年生物柴油与汽油1000万吨/年抗菌素中间体6－APA0.9万吨/年趋势判断和需求分析生物催化剂在精细化学品市场中呈现强劲的增长势头。到2020年，通过生物催化技术，将实现化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和污染扩散减少30%。趋势判断和需求分析目前生物催化技术已成为各公司争夺的目标并且已成为一些公司谋求发展和提升地位的工具。Degussa、DSM、Roche、BASF、Dow、Lonza等许多跨国公司都在积极采取措施，扩大他们在生物催化领域里的生产能力。生物催化发展的主要推动力新产品需求(社会压力)-健康：医药、检测-日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料环境(法律法规压力)－绿色化学、能源、温室效应新发现或基础研究(技术压力）－基因工程/定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学

得益/成本降低(商业压力)-生物分离TheBiocatalysisCycle产物底物2.生物催化剂改造的方法学关键科学问题生物催化剂1.生物催化剂多样性及其实现方法4.生物催化剂适应性原理5.重要催化反应体系3.生物系统催化的理论和方法初步建立生物催化和转化的理论体系发展一批有自主知识产权的基础技术发展数个重要合成途径和相关专利技术多样性（关键问题1）课题1：生物催化剂多样性的研究及数据库建设催化剂改造（关键问题2）课题2：生物催化剂改造方法学的基础与应用研究系统催化(关键问题3)课题3：生物系统催化的理论和方法适应性原理(关键问题4)课题4：生物催化剂和人工环境互适应原理以及适于生物制造工程集成新方法的研究课题8：非水相不对称催化特性课题6：糖苷酶及其催化反应特性课题5：腈水合反应和腈水解反应的方法学及催化机理课题7：生物催化氧化还原过程基本问题的研究生物制造(生物学、化学和工程学的交叉)关键理论和基本方法重要生物催化体系催化剂资源工程优化催化剂改造生物催化剂工程的目标

开发生物催化剂：催化性能更好、更快，成本更低开发生物催化剂工具合：催化反应更广泛，功能更多样

改善性能:稳定性,活性，溶剂兼容性开发分子模型:新酶的快速重新设计创造新技术:用于新生物催化剂的开发

生物催化剂发展的工业展望CompetitiveImperativeCurrentChemicalVarietiesCurrentBiocatalystsBiocatalystoftheFutureSpeedtoMarket2-5years10years2-3yearsCosttoManufacture$1-10/kg$10-100/kg$1-3/kgRangeofProductsBroadNarrowBroad生物催化剂工程技术瓶颈对生物催化剂作用机理缺乏深入的认识对次级代谢产物代谢途径（包括途径间相互关系）缺乏理解细胞工程化的方法十分有限（即代谢工程）生产酶和辅因子的成本过高当前生物催化的研究热点新酶或已有酶的新功能的开发根据已有底物开发新的酶反应利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系体内或体外合成的多酶体系克服底物和产物抑制精细化工品或医药合成技术的放大辅因子再生生物催化剂的修饰生物催化剂的固定化生物催化剂高效生产与催化功能研究强化微生物细胞培养与发酵的调控措施，研究酶的诱导策略实现生物催化剂的自主和规模生产分析生物催化剂所催化的特定基团开辟全新的生物催化反应第二节研究内容一．概念：二．酶学研究简史三．研究内容一．概念：酶工程（EnzymeEngineering）从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。定义：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。酶的催化高效性通常要高出非生物催化剂催化活性的106~1013倍。2H2O22H2O+O21mol过氧化氢酶5×106molH2O21mol离子铁6×10-4molH2O21.1酶的定义回本章目录生物催化剂的发现微生物可培养微生物酶资源的开发利用不可培养微生物酶资源的开发利用基因已知基因的克隆未知基因的克隆二.酶学研究简史1878德国的Kuhne

定义Enzyme原意为在酵母中1926美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶（1947年诺贝尔奖）1970美国的Smith发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖）1969日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。——酶工程诞生1986美国核酶发现获得诺贝尔奖1.2酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也酶酒西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。1878年,给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。后来对酶的作用机理及酶的本质做了深入研究，1930年，证实酶是一种蛋白质；80年代初发现了具有催化功能的RNA——核酶(ribozyme)，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域，现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。酶的应用历史1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。50年代以后,随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。50年代：开始了酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。1978年,日本的铃木等固定化细胞生产α-淀粉酶研究成功.所以说,70年代是固定化细胞技术取得进展的时期.80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶,因此,80年代又发展了固定化原生质体技术,排除了细胞壁这一障碍。在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进展。60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变;70年代,修饰剂的选用、修饰方法上又有了新的发展。此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。回本章目录1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：1.3酶的分类与命名EC分类的六大类酶1.氧化还原酶类：催化氧化还原反应。2.转移酶类：催化分子基团从一个分子转移到另一个分子。3.水解酶类：催化水解反应。4.裂解酶类5.异构酶类6.连接酶类或合成酶类。Eachenzymeisnowclassifiedandnamedaccordingtothetypeofchemicalreactionitcatalyzes.Soanenzymeisassignedafour-numberclassificationandatwo-partname

calledasystematicname.InadditionrecommendednameissuggestedbyIUBforeverydayuse.E.C.X.X.X.X乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)氧化还原酶Oxidoreductase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。

例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)转移酶Transferase水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。(4)裂合酶Lyase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)异构酶Isomerase合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi

例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase（一）酶的化学本质1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。酶的化学性质与催化特性（二）酶的组成酶单纯酶结合酶（全酶）=酶蛋白+辅因子辅因子辅酶与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。金属激活剂金属离子作为辅助因子。酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分。辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。（三）单体酶、寡聚酶和多酶复合物1.单体酶（monomericenzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。3.多酶复合物(multienzymesystem)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（EⅠ）、硫辛酰转乙酰酶（EⅡ）和二氢硫辛酰脱氢酶（EⅢ）。EⅠEⅡEⅢ碱性EⅠEⅡEⅢ+EⅡEⅢ+脲(四)活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性(五)酶作用的专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。(六)影响酶催化的各种因素1、酶活力与酶反应速度，比活力2、酶活力测定方法反应体系选择/

反应条件确定反应物检测/酶活力计算偶联酶反应活力测定3、酶活力单位

1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。这个单位称为国际单位。

(七)酶活力测定

dSdPu=-----=-----

dtdt回本章目录（1）酶活性部位的化学鉴定鉴定酶分子的活性部位是研究酶催化功能的重要课题。分为四种方法：化学修饰；反应动力学；X-射线衍射以及蛋白质工程发展后基因核苷酸诱变法。.化学修饰：原则上讲，酶分子的侧链上的各种基团，羧基、羟基、氨基、吲哚基等均可作为化学修饰的对象，当其被一种化学试剂修饰后酶活力显著下降甚至丧失则表明该基团为活性部位。分为a.非特异性修饰

b.差示标记

c.亲和标记动力学分析法因酶蛋白是许多解离基团的两性电解质。pH改变，必然影响解离基团的离解状态。处于活性部位的离解基团的离解状态变化，必然导致酶活变化，因此，研究pH与酶活的关系，可提供活性部位某些基团的pK值，进而推断此基团的作用，通过动力学参数，如Vm和Km与pH的关系，可求解酶活性部位的离解基团。X-射线衍射化学标记和动力学分析可推断酶活性部位的一级结构，酶活中心的空间结构信息需要用X-射线衍射分析。④定位诱变法。酶活的测定酶活力：在一定的条件下，酶所催化的反应速度。反应速度越大，意味酶活力越高。酶的反应速度，用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。

V=-ds/dt=dp/dt1.酶活力的测定方法步骤在酶活力测定过程中一定要选择最合适的条件，使酶与作用底物反应一段时间后，再测定反应液中底物或产物的变化量。一般有如下步骤：（1）根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物浓度溶液。（2）根据资料或实验结果，确定反应的温度，pH等条件。（3）在一定的条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，适时记录反应开始时间。（4）反应一定的时间，取适量的反应液测定底物或产物的变化量。如不能立即测定结果，也应将酶反应终止。终止反应的方法：

a.反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水中，加热使酶失活。

b.立即加入适宜的酶变性剂。

c.加入酸或碱，使体系pH迅速远离反应的最佳pH。

d.将反应液置于冰水中，使反应温度迅速降低至10°C以下。测定反应液中物质的变化量可采用光学检测法，化学检测法等生化检测技术。2.酶活力单位酶火力的高低是以酶活力单位来表示的。为此酶活力单位需要一个确切的定义：1961年国际生化联合会规定：在特定条件下，每1min催化1umol的底物转化为产物的酶量定义为1个活力单位。这个单位称为酶的国际单位（1U）。酶的比活力：在特定条件下，每1mg酶蛋白所具有的酶活单位数。有时也采用每1（m）l酶液或每g酶制剂的活力单位数来表示。酶的比活是为了比较酶制剂的纯度和活力的高低。3.固定化酶活力的测定与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。a.震荡测定b.柱法测定c.连续测定d.固定化酶的比活力测定。在固定化酶的比活力测定中，一般采用每1mg干固定化酶所具有的酶活力单位数表示，即为[单位/mg干固定化酶]。为此在测量时，需要先测定湿固定化酶的酶活力，然后将固定化酶在一定条件下干燥，称取固定化酶的干重，然后通过计算得出固定化酶的比活力。对于酶膜，酶板或酶管等固定化酶，其比活力则以单位面积的酶活力来表示，即[酶活力（单位）/cm2]e.酶结合效率与酶活力回收率的测定：将一定量的酶进行固定化时，不是全部酶都成为固定化酶，而总是有部分酶没有与载体结合在一起。为了确定固定化效果，需要测定酶的结合效率或酶的活力回收率。酶的结合效率一般由加入的总酶活力减去未结合酶活力的差值与加入的总酶活力的百分比来表示。酶结合效率=加入的总酶活力-未结合酶活力加入的总酶活力×100%未结合酶活力，包括固定化后滤出的滤液以及洗涤固定化酶的洗涤液中所含有的酶活力和。酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的酶的总活力的百分比酶活力回收率=固定化酶总活力用于固定化的酶的总活力×100%当固定化方法对酶活力没有明显的影响时，酶结合率与酶活力回收率的数值相接近。然而固定化载体或固定化方法往往对酶活力有一定的影响，两者的数值往往有很大的差别，所以通常都通过测定酶的结合效率来表示固定化的效果。f.相对酶活力的测定具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。固定化酶的相对酶活力与载体结构、颗粒大小、底物分子量大小以及酶结合效率等有密切的关系。相对酶活力的高低表明了固定化酶应用价值的大小，相对酶活力太低（<75%）的固定化酶，一般没有实用价值。因此应重视固定化载体、固定化技术的研究改进。酶的结构和功能一.酶蛋白的结构特征酶蛋白和其他蛋白质一样，由20种基本氨基酸按一定的顺序排列，此即为酶蛋白的一级结构。具有一定结构的多肽链以一定规则的氢键形成-螺旋，-折叠，-转角和自由盘绕等为二级结构。这些二级结构单元进一步盘曲折叠，形成环状分子，即三级结构。若酶蛋白具有四级结构，则必须具有两条或多条肽链。球状分子表面以疏水作用力、范德华力、氢键等非共价键互相连接起来，形成完整的酶分子。这些组成四级结构最小单位的肽键称为亚基，而把含亚基不太多的蛋白质称为寡聚体蛋白酶。1.酶一级结构的特征a.氨基酸组成与酶功能的关系：酶蛋白中的氨基酸均为L-型氨基酸，其组成或多或少与所催化的反应性质和酶的来源有关。来源不同的同一酶或功能相似的酶，氨基酸组成相近，但不相同，存在生物种层间的差异，甚至存在个体、器官、组织间的差异。b.氨基酸的排列顺序与酶的催化活性的关系。酶的一级结构与酶的催化活性有密切关系。酶的催化活性，取决于构成活性中心的少数氨基酸在整个肽链中的顺序位置。同一酶和功能相近的酶，其活性中心附近的氨基酸序列具有惊人的相似性；序列间的差异一般发生在远离活性中心的地方。C.主肽链结构特征及二硫键酶蛋白的主链不分支；同一肽链的不同位置点之间，或者不同肽链之间，可以通过胱氨酸的二硫键形成环，也可以通过辅基与肽链的不同位点之间以共价键或配位结合，形成一定的环状结构，使分子结构相对稳定。在酶分子中二硫键的位置和数目由整个一级结构决定了它的恒定性。二.酶蛋白的二级结构特征1.二级结构单元有-螺旋，-折叠，-转角和无规则卷曲四种。它们是形成更高结构的基础。2.-螺旋和结构的分布全-蛋白，即仅由-螺旋组成的蛋白质。全-蛋白，即仅由-折叠组成的蛋白质。+蛋白，由-螺旋和-折叠组成。/蛋白，-螺旋和-折叠交替出现。3.结构单元在酶结合配基过程中可以发生位移和转变。三.酶蛋白的三级结构特征1.球形外貌X-射线衍射法分析酶亚基或多或少呈现球形外观。2.三级结构的一般规律许多酶分子亚基自发形成特定三维结构时，-折叠总是沿主肽链方向呈右扭曲，构成圆桶形或马鞍形结构骨架，而且平行的-折叠结构的实例居多。3.结构