免疫组织化学

免疫组化概念

组织包埋液

步骤

抗原修复原因和方法

结果判断假阴性假阳性

质量控制

表上的抗体

CD34，CD68

B细胞标记物

T细胞标记物：3、7

细胞角蛋白免疫组织化学

(Immunohistochemistry，IHC)南京鼓楼医院病理科王景美

免疫组织化学概念免疫组织化学或免疫细胞化学应用免疫学(抗原抗体反应）和组织化学（化学显色反应）的原理，对组织切片或细胞标本中的某些成份进行原位定性、定位甚至定量研究的技术。免疫组织化学的发展历史1941：Coons－实用免疫荧光技术1970：Sternberger－抗体酶标技术（PAP法）1975：Kohler,Milstein－单克隆抗体技术1981：Hsu－ABC法90年代以来：SP法、原位杂交及原位PCR免疫组化技术等全自动免疫组化检测系统及原理基本步骤结果判断特点及存在的问题常用免疫组化抗体免疫组化的应用内容

检测系统及原理抗原与抗体抗原：指能刺激机体产生抗体，并能和该抗体发生特异性结合的外来物质。抗体:多克隆抗体:由多个B细胞克隆产生的不同种类的免疫球蛋白,可与同一抗原的不同表位结合，可由多种动物产生，兔最常用单克隆抗体:由单一类别的免疫球蛋白组成，来源于单一B细胞，与抗原的特异表位结合，主要由鼠产生检测系统：直接法、间接法直接法73substrate-chromogen显色底物加底物产生有色终产物Enzyme酶primaryAb一抗Antigen抗原酶标一抗与组织抗原相结合酶分子直接标记第一抗体（酶标一抗）快速/简便/专一性强。信号弱、敏感性差免疫荧光技术多数采用此法，荧光素直接标记在一抗上现极少用71酶标二抗与非标记的一抗相结合如果一抗是鼠来源的，二抗必须抗鼠免疫球蛋白。比直接法敏感，因为多个二抗很可能与一抗上的多种不同表位结合，增加标记酶的数量。76间接法二步间接法77primaryAb(mouse)非标记一抗与组织抗原结合secondaryAb(rabbitanti-mouse)Enzyme酶标二抗与一抗相结合substrate-chromogen显色底物加底物产生有色终产物PAP法ABC法链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶连接法（LSAB/SP法）

二步法(Envision系统)二抗和辣根过氧化物酶(HRP)结合在多聚葡萄糖骨架上，形成多聚体。直接放大信号40-50倍间接法大多数实验室现在使用:卵白素-生物素过氧化物酶系统（如

ABC,SABC,LSAB）多聚物检测系统（如EnVision）这些系统对大多数抗体来说稳定且灵敏以前普及的

PAP方法（过氧化物酶抗过氧化物酶）现在已较少使用

免疫组织化学方法的基本步骤1、组织细胞的准备

固定—取材—脱水—透明—浸蜡—包埋切片组织

固定液

10％中性福尔马林缓冲液：最好、最经济和广泛适用的固定剂，形态及抗原保存俱佳（需用有效的抗原修复）其它固定液：如含酸或含汞的固定液，就抗原保存来说均不理想某些商品化的固定液：保存抗原较佳，且价格昂贵组织固定时间

为确定组织在中性福尔马林液中固定的最佳时间，需要权衡下列因素：尽量缩短固定时间，但至少要固定24小时长时间的福尔马林固定会引起抗原性丢失（虽然可通过适当的抗原修复在某种程度上逆转）取材

脱水透明浸蜡

包埋切片封片HE染色及选择蜡块和抗体HE染色挑选免疫染色的组织块

选含有明确的病变组织块做免疫组化，并尽可能避免下列组织块：后来另取的组织（固定时间过久）冻融后的组织脱钙的组织（有些抗原可能丢失或减弱）坏死或/和出血过多的组织

免疫组织化学方法的基本步骤1、组织细胞的准备固定—取材—脱水—透明—浸蜡—

包埋切片—HE染色—选择蜡块和抗体2、组织切片的脱蜡和抗原修复抗原修复

应用物理或化学的方法将组织固定过程中封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复。

抗原修复

原因：甲醛固定过程中形成醛键而封闭部分抗原决定簇；甲醛在保存过程中形成羧甲基，封闭抗原决定簇；固定时，蛋白与蛋白之间发生交联,可能会封闭抗原决定簇。抗原修复的方法蛋白水解酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶和组织蛋白酶热抗原修复（HIER）--最常采用超声波以上综合运用热诱导的抗原修复水浴：微波炉、高压锅、高压消毒锅、蒸汽室及煮沸等。需不同浓度和pH值的缓冲液：常用

citrateatpH6.0,EDTAatpH8.0,

Tris-HCLatpH10.057热修复的优点：更有效：染色结果更一致，操作更单一；事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织

一抗可以进一步稀释（节省费用）有些抗体只有采用热抗原修复才有效NoAntigenRetrieval不修复处理Citratebuffer,pH6.0

柠檬酸缓冲液58

经抗原修复处理和不处理时,CD3在扁桃体组织上的染色效果

免疫组织化学方法的基本步骤1、组织细胞的准备固定—取材—脱水—透明—浸蜡—

包埋切片—HE染色—选择蜡块和抗体2、蜡块组织脱蜡和抗原修复3、组织抗原和一抗结合反应注意最佳的一抗滴度时间不宜过长、过短温度不宜过高溶液不宜过少洗涤充分

免疫组织化学方法的基本步骤1、组织细胞的准备固定—取材—脱水—透明—浸蜡—

包埋切片—HE染色—选择蜡块和抗体2、蜡块组织脱蜡和抗原修复3、组织抗原一抗结合反应4、一抗和桥抗的结合反应

免疫组织化学方法的基本步骤1、组织细胞的准备固定—取材—脱水—透明—浸蜡—

包埋切片—HE染色—选择蜡块和抗体2、蜡块组织脱蜡和抗原修复3、组织抗原一抗结合反应4、一抗和桥抗的结合反应5、显色、衬染结果观察AEC

DABMart-1Melanoma66AEC和DAB染色图例SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAparaffinwax石蜡Paraffinwax

tissuesection石蜡包埋组织片二步法染色步骤举例(CEA)SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAtissuesection组织片DeparaffinizationandRehydration脱蜡\水化SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEA3%HydrogenPeroxideDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶3%过氧化氢10分钟灭活内源性过氧化氢酶SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBufferDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶RinsePBS洗三次20:00SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEARinseAntigenRetrieval抗原修复DeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶柠檬酸缓冲液微波修复20分SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBufferRinseDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复Rinse蒸馏水冲洗后,PBS洗3次SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEACEAAntibodyPrimaryAntibody一抗DeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复RinseRinse最适稀释的CEA抗体孵育60分钟SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBufferBlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗RinseRinseRinsePBS洗3次DeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAAntibody-HRP

SecondaryAntibody葡聚糖二抗RinseDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗RinseRinse二抗孵育20分钟SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAPBSBuffer

SecondaryAntibody葡聚糖二抗RinseDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗RinseRinsePBS洗3次PBSBufferSPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEADABChromogenDABChromogenDAB底物DeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗SecondaryAntibody二抗

RinseRinseRinseRinseRinse加DAB10分钟SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEADistilledWaterDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗

SecondaryAntibody

二抗DABChromogenDAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinsePBS洗3次,蒸馏水清洗SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAMayer’sHematoxylinDeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗SecondaryAntibody

二抗DABChromogenDAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinseHematoxylinCounterstain苏木精复染苏木素复染1分钟SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEATapWaterHematoxylinCounterstain苏木精复染DeparaffinizationandRehydration脱蜡和水化BlockEndogenousPeroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复PrimaryAntibody一抗

SecondaryAntibody

二抗DABChromogenDAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinseRinse流水冲洗,细胞核返蓝SPECIMENxM-0194ColoncarcinomaM-0194CEAAqueousMountDeparaffinizationand

Rehydration脱蜡和水化Block

Endogenous

Peroxidase阻断内源性过氧化物酶AntigenRetrieval抗原修复Primary

Antibody一抗

Secondary

Antibody二抗DAB

Chromogen

DAB底物RinseRinseRinseRinseRinseRinseHematoxylin

Counterstain苏木精复染RinseAqueousMount水性封片封片注意显色时间适当（要求镜下观察）衬染不宜太浓判断染色质量观察受染细胞

结果判断严格抗原表达的部位和形式严格染色强度设对照：阳性、阴性对照或内部对照当免疫组化结果与HE切片判断有矛盾时,以HE切片诊断为准结果判断？？？阳性反应的分布：不均匀性或异质性。阳性可出现在单个细胞内、一群细胞中或整个组织中。弥漫一致的浅染可能为非特异性反应。阳性反应定位：胞膜，胞浆，胞核，胞核/胞浆明确定位(膜,浆,核)，是观察免疫组化结果的最终依据！C-erbB2胞膜阳性Ki67胞核阳性CK7弥漫或片状的细胞浆阳性CD68细胞浆内颗粒状阳性

Actin细胞浆纤维状阳性S-100阳性的半定量－乘积法

强度：0分无色

1分淡黄色

2分棕黄色

3分棕褐色。细胞数:0分无

1分≤10％

2分11－50％

3分51－75％

4分>75％。两者乘积>3分为阳性。阳性的半定量－百分比

(+)阳性细胞数<25%(++)阳性细胞数>25%,<50%(+++)阳性细胞数>50%,<75%(++++)阳性细胞数>75%阳性细胞数<25%(++)25%<阳性细胞数<50%(+++)50%<阳性细胞数<75%(++++)阳性细胞数>75%免疫组织化学的特点和问题特异牲强敏感性高定位准确、形态与功能相结合假阳性假阴性非特异性技术本身的问题免疫组化的优点特异牲强敏感性高定位准确、形态与功能相结合“一对一”的抗原抗体反应，如LCA显示淋巴细胞。只有在组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

免疫组化的优点特异牲强敏感性高定位准确、形态与功能相结合

直接法，间接法：抗体的稀释只能是几倍、几十倍。ABC法、SP法，两步法等：抗体稀释上百上千倍。越来越方便应用于临床常规诊断工作

免疫组化的优点特异牲强敏感性高

定位准确、形态与功能相结合

原位确定组织及细胞结构的化学成分.

方法统一,定性可靠、定位准确、定量可能。形态学被赋予了功能及代谢的含意。

假阴性与假阳性问题

假阴性原因抗原丢失抗原修复不适当方法不足够敏感失效的抗体加错试剂或试剂摆放位置错误假阳性原因

非特异性反应：边缘现象；皱折和刀痕；出血和坏死；组织挤压；被动吸收和主动吞噬而使抗原出现在不该出现的部位抗体与多种抗原有交叉反应内源性酶的显色试剂浓度过高异位抗原的表达非特异性着色（全片）1、抗体浓度过高2、抗体孵育时间过长或温度较高3、DAB变质和显色时间太长4、组织变干5、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长6、一抗变质、质量差的多克隆抗体

边缘效应“阴阳脸”着色试剂仅覆盖了部分组织而不是全部

固定不足、组织变干非特异性染色气泡灶片状着色1、裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起2、坏死组织灶3、制作APES涂胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色灶状着色：机械原因着色坏死组织着色：AE1/AE3非特异性反应,出血和坏死

胞浆着色过氧化物酶（红细胞着色）

胞浆着色一抗过浓或交叉反应：P63（乳腺）

免疫组织化学的新进展高效的抗原修复技术（即使不同方式固定或处理的组织仍能得到一致的结果）高度敏感的检测系统大量能应用于常规石蜡切片的抗体双染甚至三染免疫组化技术免疫组化自动化抗体必须经过验证研究

由于组织固定、脱水过程、包埋等内在影响因素的变化，不可能建立一个通用的免疫组化染色程序？对照的设立阳性对照与阴性对照内对照空白对照组织微阵列免疫组化的质量控制常用免疫组化抗体上皮组织标记物间叶组织标记物淋巴造血系统标记物神经及内分泌标记物肿瘤相关抗原标记物器官或组织特异性抗原标记物病原体标记物1、上皮组织标记物

角蛋白系列（cytokeratin,CK）上皮膜抗原（epithelialmembraneantigen,EMA）癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）CK的概述CK--抗体在外科病理实验室应用最为广泛多年以来由于各种特殊亚型的CK抗体出现使得CK的应用更加广泛什么是CK?中间丝（重要的细胞骨架蛋白）见于所有的上皮细胞及间皮细胞整个家族中有40-68kD的不同分子量及等电点pH

至少有20个亚型（酸性或碱性）低分子量CK中间分子量

CK高分子量

CKCK-pan（如MNF-116）或鸡尾酒调制CK（如MAK6）CAM5.234ßE12AE1/AE3CK5/6什么是

CK?CK1，CK2和

CK10：最高分子量细胞角蛋白，仅表达在鳞状上皮的角化层CK5,CK6和

CK14:高分子量细胞角蛋白，表达于鳞状上皮及基底细胞CK7,CK8,CK18和

CK19:低分子量细胞角蛋白，表达在单层上皮和内分泌细胞其它

CK亚型为中间分子量最常用，胞浆阳性着色，细丝状，用于确定肿瘤为上皮源性波形蛋白（vimentin，VIM）肌组织标记物血管内皮细胞的标记物组织细胞的标记物2、间叶组织标记物波形蛋白（vimentin，VIM）

中间微丝蛋白分布于间叶细胞及其起源的肿瘤也见于上皮性肿瘤已建议废弃肌原性标记

•Desmin

胞浆阳性着色

平滑肌/骨骼肌及其肿瘤的良好标记，肌纤维母细胞有时也阳性，但肌上皮阴性

一些间皮瘤阳性

促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤

肌源性标记

•MSA（Muscle-specificactin）

胞浆阳性着色

极好的肌源性标记

平滑肌、骨骼肌及其肿瘤

肌纤维母细胞及相关肿瘤（恶纤组、结节性筋膜炎等）

肌上皮及其肿瘤

血管周细胞肿瘤

一些间皮瘤血管内皮细胞的标记物

第八因子相关抗原（factorⅧrelatedantigen,F-8）荆豆凝集素（ulexeuropaeusUEA-1）

CD34CD31D2-40血管源性标记

•CD31

细胞膜阳性着色

内皮细胞、巨核系细胞/血小板阳性

有时浆细胞/浆细胞瘤阳性

主要用于诊断血管性肿瘤：特异且敏感

用于识别骨髓中不正常的巨核细胞

用于巨核细胞系白血病血管源性标记

•CD34

细胞膜/细胞浆阳性着色

血管内皮/巨核细胞/血小板

很好的血管标记，但特异性差

多种肿瘤CD34阳性，包括：血管瘤、血管周细胞胃肠间质瘤等组织细胞的标记物

α1–抗胰蛋白酶(α1-antitypsin,AAT)和

α1－抗糜蛋白酶（α1-antichymotrypsin,AACT）溶菌酶（lysozyme,Lys）CD68组织细胞标记

•CD68（PGM1）

胞浆内颗粒状阳性着色

较好的组织细胞和单核细胞及其肿瘤的标记

有些非组织细胞也可阳性，包括：肾小管、粒细胞肉瘤、恶黑、血管瘤样恶纤组等

3、淋巴造血系统标记物

白细胞共同抗原（leucocytecommonantigen,LCA,CD45）免疫球蛋白(immunoglobulinIg)B细胞标记物

T细胞标记物

T淋巴细胞亚群标记物粒细胞和单核—巨噬细胞相关标记物其他白细胞标记

•LCA（CD45RB）

几乎所有的白细胞、浆细胞瘤（+）

HE下明确的淋巴瘤不必要染LCA

有些淋巴母细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤（-）

经典Hodgkin的R-S细胞（-）

B细胞相关标记CD20（L26）胞膜阳性着色CD79a胞浆阳性着色:各阶段B细胞阳性B祖细胞前B细胞未成熟的B细胞成熟的B细胞激活的

B细胞浆细胞前体细胞;非抗原依赖型初始

B细胞;非抗原依赖型生发中心和标志;抗原依赖型TdTCD20,CD22CD19,PAX5CD79aCD10Bcl-6CD138细胞浆

CD22

全T细胞标记物

CD3CD5CD7CD45ROCD43

用于T淋巴细胞和其起源肿瘤的识别T细胞相关标记

•CD3（polyclonal）

胞浆/膜阳性着色，核周凝聚，有时高尔基体也阳性

极好的T细胞标记，与CD43不同，髓系细胞和组织细胞不着色

极好的T细胞和NK淋巴瘤标记粒细胞和单核巨噬细胞相关标记物CDl5(LeuM1)髓过氧化物酶（MPO）CD68MAC387溶菌酶(lysome)组织细胞标记

•CD68（PGM1）

胞浆内颗粒状阳性着色

较好的组织细胞和单核细胞（包括浆样单核细胞）及其肿瘤的标记

有些非组织细胞也可阳性，包括：肾小管、粒细胞肉瘤、恶黑、血管瘤样恶纤组等

4、神经及内分泌标记物神经组织标记物

胶质纤维酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)S-l00蛋白神经元特异性烯醇酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)髓磷脂碱性蛋白(Myelinbasicprotein，MBP)神经元特异核蛋白(NeuN)少突胶质细胞转录因子-2(Oligo-2)内分泌和神经内分泌系统标记物垂体激素:GH、LH、ACTH、Prl、FSH、TSH胰岛细胞、胃肠道和呼吸道激素神经元特异性烯醇化酶(NeuronSpecificEnolase，NSE)

嗜铬颗粒蛋白(ChromograninA，CgA)

突触囊泡蛋白(Synaptophysin，Syn)•GFAP（Glialfibrillaryacidicprotein）

胞浆阳性着色

星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头状瘤阳性

一些外周神经鞘瘤可阳性

涎腺多形性腺瘤常可阳性

乳腺的肌上皮有时也可阳性

S-100

细胞核、细胞浆阳性着色

神经源性肿瘤、恶性黑色素瘤、肌上皮肿瘤、脂肪肿瘤•Syn

细胞浆阳性着色

神经和神经内分泌细胞及肿瘤、神经元和神经节细胞（+）

特异性和敏感性均好

•CgA

胞浆内颗粒状着色

染神经内分泌细胞的分泌小泡

类癌、Merkel细胞癌、甲状旁腺腺瘤等强阳性

神经性肿瘤可阳可阴

5、肿瘤相关抗原标记物肿瘤基因蛋白(oncoprotein)Bcl-2