生物工艺学基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶

基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。

基因工程工具酶

自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己

DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。基因工程工具酶基因工程工具酶及其应用限制性核酸内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA连接酶—用于DNA和RNA的连接DNA聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)限制性内切酶的发现

限制性内切酶的分类

限制性内切酶的命名

限制性内切酶的活性单位

限制性内切酶的切割特点

限制性内切酶的反应条件

限制性内切酶的应用

一

.限制性内切酶的概念核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。限制性核酸内切酶的发现

细菌的限制—修饰作用1952年，Luria

和

Human，1953年，Bertani

和

Weigle

发现细菌的限制（restriction）现象：Phageλ（k）

E.colikE.coli

B【E.coliB限制

λ（k）】感染不感染噬菌体侵染细菌噬菌体侵染细菌

仍有少量phageλ(K)可在

E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）R-M系统

细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统

(R-MRestriction-modificationsystem)。

R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌

R-M系统的限制酶可以降解

DNA，为避免自身

DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身

DNA，未被修饰的外来

DNA则会被降解。

个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。

限制性内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现1968Linn和

Arber

从

E.coliB中发现限制酶Ⅰ

1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans

因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链

DNA分子中的特定核苷酸序列，并对

DNA分子进行切割的一种酶。功能：降解不同源

DNA，而不降解同源

DNA。EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的活性单位50μLBuffer中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μgDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巯基乙醇100μgBSA/ml（DDT：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白)限制性核酸内切酶的切割特点在

DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割

DNA分子，产生链的断裂。2个单链断裂部位在

DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的

DNA片段，具有互补的单链延伸末端。识别序列

绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。

识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。ABCC’B’A’

A’B’C’CBAA’B’N’BAABNB’A’

ABB’A’

ABB’A’

或或EcoR

Ⅰ5‘……GAATTC……3’

3’……CTTAAG……5’

不同核酸内切酶的特异识别位点PstⅠ5’……CTGCAG……3’

3’……GACGTC...…5’

AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用三、种酶切末端

平齐末端（如

SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）

5’-GGCC-3’

3’-CCGG-5’

5’-GG--CC-3’

3’-CC--GG-5’

5’粘性末端（如

EcoR

Ⅰ）

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-G--AATTC-3’

3’-CTTAA--G-5’

3’粘性末端（如

Pst

Ⅰ）同裂酶和同尾酶

同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。

如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割CCGG。当胞嘧啶甲基化后，

MspⅠ不能再切割。

同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后

DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。5’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三种酶可产生相同的

5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的

DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。限制性核酸内切酶的反应条件1.底物

DNA

（1）DNA纯度:RNA与

E结合影响有效酶浓度；

（2）DNA浓度:[DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散

如：4μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃15h1μgDNA/1UHPaⅠ50μl37℃1h

（3）识别位点及邻近位点特异性序列

如：pBR322DNA有

4个

NarⅠ切点

(GGCGCC)其中

2个切点用1U酶水解

1h完全切开,2个切点用50U酶水解

16h水解不完全。

XmaⅢ

切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。（4）DNA二级/三级结构

如：超螺旋

DNA(病毒或质粒)比线状

DNA需酶多（5）提取时混入杂质可改变识别特异性

如：

高浓度

Hg2+、酚、

氯仿、乙醇、EDTA、

SDS、NaCl

等。

2.反应系统因素

（1）缓冲液（无菌、无污染）（2）金属离子

如：Ⅱ型酶需

Mg2+，若以

Mn2+代替Mg2+（如HindⅢ，EcoRI）则特异性改变。

离子浓度不合适会抑制酶活。（3）牛血清蛋白

(BSA)

BSA是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量

BSA会引起电泳拖尾。限制性核酸内切酶的反应条件3.星活性

限制性内切酶识别特异性放宽。

EcoRⅠ在正常情况下识别

GAATTC序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过

5%，其识别位点发生松动，可在

AATT处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用

EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。

影响因素：甘油浓度

12-20%，酶与

DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇

(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。限制性核酸内切酶的反应条件重组DNA前的切割

构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交

用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针

亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸内切酶的应用重组DNA前的切割

构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交

用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针

亚克隆以用作序列分析基因定位，DNA同源性研究

限制性核酸内切酶的应用

甲基化酶分两类：

维持性甲基化酶：用于在新合成的

DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。构建性甲基化酶：用于在非甲基化的

DNA链上进行甲基化的酶。

用甲基化酶进行甲基化的作用封闭

DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点DNA连接酶（ligase）

能够催化

DNA中相邻的

3’-羟基和

5’-磷酸基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键;T4DNA连接酶

可连接带匹配粘性末端的

DNA分子，也可使平端的双链

DNA分子相互连接。大肠杆菌

DNA连接酶

只能连接带匹配粘末端的

DNA分子.ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5´

5´5´5´(1)(2)AATTC······GG······CTTAAAATTC······GG······CTTAA5´5´AATTC······GG······CTTAA5´

5´(a)分子间连接(b)分子内连接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶一.DNA的连接方法两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构.1.直接连结法---该法适用于:1)

同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端

重组DNA可用同种酶再切开2)不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端

i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglIIii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI3)PCR产物与特定载体的连接

4)限制酶和其他方式产生的平末端.2.人工接头连接法1)人工接头（linker）的结构

i.中轴对称互补,可自行退火形成双链.如:5'-CCGGAATTCCGG-3'3'-GGCCTTAAGGCC-5'ii.至少有一特定的限制酶识别位点

iii.某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如:

八聚体d(GGAATTCC)

十聚体d(CGGAATTCCG)

十二聚体d(CCGGAATTCCGG)2)用途

i.平整末端的连接(各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末端)2X5'-CCGGAATTCCGG-3'退火

ii.产生新的克隆位点

iii.合成匹配接头3)连接方法

人工接头磷酸化退火形成双链与目的DNA相连限制酶切两DNA分子相连4)适用范围

人工接头连接法适合于那些只有一种DNA片段需加人工接头就可以与另一DNA分子相连的DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端的DNA分子相连.这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的DNA可能具有不同的结构.为避免这些结构的产生,可先使一种DNA先加上人工接头后,再与另一种DNA分子相连.3.匹配接头连接法人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子:i.平端+突起末端(5’-突起,3’-突起)ii.粘性末端(5’-突起+5’-突起:EcoRI+HindIII5’-突起+3’-突起:EcoRI+PstI3’-突起+3’-突起:PstI+SacI)1)

匹配接头的结构特点

i.

由两个低聚核苷酸组成

ii.部分区域可以互补

iii.退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端2)

匹配接头的种类

i.

预制匹配接头(连接平端和粘性末端)

人工接头+匹配接头预制匹配接头

ii.转换匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)

二匹配接头退火转换匹配接头二人工接头连接酶双酶切转换匹配接头

iii.单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端)4.同聚物加尾连接法在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC.5.连接方法的选择方法选择的依据:1)两DNA分子的末端结构

2)DNA分子的限制酶谱

3)是否需要回收DNA片段连接方式的选择载体末端外源DNA末端常规连接脱磷酸化同聚物平端连接补齐,人工接头

结构结构载体加尾外切酶

5’-突起相容5’-突起第二选择第一选择不能不能不能

5’-突起非相容5’-突起不能结合使用接头不能不能第一选择

3’-突起相容3’-突起唯一选择不能不能不能不能

3’-突起非相容3’-突起不能不能第一选择不能第二选择或平端

3’-突起5’-端突起不能不能第一选择不能第二选择

(补齐后)

平端平端不能可能可能第一选择可能平端3’-或5’-突起不能不能第一选择不能第二选择二.DNA的连接反应

1.

连接反应理论当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关:1)

连接反应系统中的总DNA浓度i2)

一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j,该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化)3)

两种不同DNA分子的克分子浓度之比值.2.

连接反应条件

1)

评估连接反应结果的方法

i.

琼脂糖凝胶电泳

ii.大肠杆菌转化

2)

反应条件

i.

温度

ii.ATP浓度

iii.时间

iv.连接酶浓度

v.克分子比率DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶

指在

DNA(或

RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物

3’–OH末端聚合DNA链的一类酶。

DNA聚合酶在

DNA复制时起关键作用。

DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ（polⅠ），聚合酶Ⅱ(polⅡ)，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。

DNA聚合酶Ⅰ和

Ⅲ的比较DNA聚合酶的特点：

①

需模板

(DNA或

RNA)；

②

需引物；

③

具有三种酶活性，即

5′→3′聚合酶活性；5′→3′外切酶活性和

3′→5′外切外切酶活性。DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶Ⅰ在DNA复制过程中的作用1、

5′→3′聚合酶活性：

CCGGGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、5′→3′外切酶活性

3、3′→5′外切酶活性

GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli

DNApolIMg2++pC，pT5′TCGATAGCCAGCTATE.coli

DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5′DNA聚合酶的三种活性DNA的切口平移（nicktranslation）

DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。此时，DNA聚合酶Ⅰ的5’-3’核酸外切酶活性和5’-3’

聚合酶活性同时发生。5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘-3’外切酶活性5‘-3’聚合酶活性5‘3’5‘↓3’3‘5’5‘3’5‘↓3’3‘5’未经标记的核苷酸经标记的核苷酸DNA杂交探针的制备5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

5‘

3’

3‘

5’

********(a)(b)(c)(d)(e)(a)双链的DNA分子(b)带有3’-OH末端的单链缺口(c)polⅠ从5‘-P移去一个核苷酸(d)polⅠ将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5’-3‘方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链探针（probe）

探针：用来探知被测物存在的小

DNA或RNA叫做探针。

标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。

分子杂交：探针

DNA或

RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecularhybridization）DNA聚合酶Ⅰ

来源

E.coli，由染色体

DNA基因编码。商品上用的此酶来源于

PhageNM964整合的溶源性

E.coli。

结构

一条多肽链，MW=109，000D。

活性

5′→3′聚合，3′→5′和

5′→3′外切。Klenow来源：

E.coliDNAPolymeraseⅠ经蛋白酶水解的大片段

(Klenow

和

Henningseon.1970DNApolⅠ枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶C端

(76kd)+N端（36kd）

Klenow

5’→3’聚合3’→5’外切5’→3’外切Klenow

用途填补限制酶的

5′-粘性末端为平齐末端

5’…CC3’…GGAATT5’…CCTTAA3’

3’…GGAATT5’

Klenow3′-末端标记

Klenow

在无底物时只进行

3′→

5′外切；有底物存在时则聚合。

这种标记也称作交换标记，但

Klenow

作用不如T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶

来源：T4Phage感染的

E.coli

结构：MW=114,000d

活性：

5′→3′聚合活性；

3′→5′外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比

Klenow

大

200倍

用途

填补或标记限制酶切后产生的

5′-粘性末端的3′-凹缺末端。（同

Klenow）3′-粘性末端的标记制备

DNA探针,同

Klenow

末端标记。

T7DNA聚合酶（测序酶）

来源：T7Phage感染的

E.coli

结构：由

2个蛋白亚基组成：

T7phagegene5蛋白

+宿主硫氧蛋白

活性：

5′→3′聚合，持续反应时间最长，所以合成的

DNA链长。故在

DNA测序中很优越。

3′→5′外切，是

DNA聚合酶Ⅰ的

1000倍。用途复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列用填补或交换反应快速进行末端标记。

与

T４DNApol一样，平齐粘性末端。定点突变中互补链的合成。5′3′3′5′修饰的

T7DNA聚合酶(测序酶)

来源：

天然

T７DNA聚合酶经修饰处理

结构：

同T７聚合酶。

用还原剂、分子氧、低浓度

Fe２+与酶保温几天，可使PhageT7gene5蛋白

N-端3′→5′外切酶活性中心失活

(O-修饰)。

即：5′→3′聚合酶作用提高，持续性长。3′→5′外切作用下降

99%以上。

TaqDNA聚合酶(Thermusaqraticus)

来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种

结构：单亚基

MW=94,000d。

活性：聚合最适温度为

75-80℃，不具3′→5′外切酶活性，具5′→3′外切活性

。

用途：PCR反应。测序，高温下进行

DNA合成可减少模板二