新型有机酸的发酵法制备技术

李江华江南大学2014-9-19新型有机酸的发酵法制备技术报告内容

一.新型有机酸概况二.新型有机酸发酵研究进展举例丙酮酸发酵丙酸发酵

α-酮戊二酸发酵三.新型有机酸发酵工业展望一、新型有机酸概况

新型有机酸概述柠檬酸乳酸α-酮戊二酸丙酸琥珀酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸，其酸性源于羧基

(-COOH)新型有机酸概述新型有机酸是指一系列在食品、医药和化工等领域具有重要应用价值，但是长期以来由于结构复杂性和较高的化学反应活性无法在工业规模进行低成本生产的有机酸。其中丙酮酸、-酮戊二酸和丙酸等，由于化学合成工艺复杂，成本长期维持在10万元/吨以上(普通有机酸价格仅为0.4-1万元/吨)，导致下游产品成本居高不下，妨碍了其大规模应用。二.新型有机酸发酵研究进展－丙酮酸丙酮酸的应用领域丙酮酸农业：阿托酸、谷物保护剂等多种农药合成前体食品工业：

功能饮料添加剂

减肥食品酸味剂医药工业：原料药药物合成前体药物佐剂日化工业：防腐剂抗氧化剂诊断检测试剂：伯醇/仲醇检定转氨酶测定脂肪族胺显示剂丙酮酸的生产方式比较化学法代谢工程改造：酶转化法发酵法筛选得到的菌种：光滑球拟酵母酿酒酵母大肠杆菌原料成本高环境污染严重原料成本高来源有限最适pH值高易感染噬菌体丙酮酸耐受性差转化率较低，副产物多生产周期较长发酵过程不稳定最适pH值低不易染菌无噬菌体高丙酮酸耐受性发酵法生产丙酮酸GlucosePyruvateGlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1：硫胺素NA：烟酸Bio：生物素B6：吡哆醛

30

60

90

120

2

4

6

8

0.01

0.02

0.03

0.04

0.1

0.2

0.3

0.4

0.01

0.02

0.03

0.04

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

0

0.05

0.1

0.15

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

0

丙酮酸

/g×L-1

0

0

0

0

150

烟酸

/mg×L-1

硫胺素

/mg×L-1

吡哆醇

/mg×L-1

生物素

/mg×L-1

核黄素

/mg×L-1

葡萄糖消耗

/g×L-1

细胞生长

/OD660

丙酮酸产率

/g×g-1

选育维生素缺陷型酵母光滑球拟酵母丙酮酸代谢优化培养基中维生素供给XXXX菌株选育不同kLa下发酵动力学曲线不同kLa下溶氧、产率变化ConstantkLa

/h-1Parameters450300200r

(IG)/(g/L)118.6119.4124.8r

(RG)/(g/L)

11.9

13.2

6.4Totalfermentationtime/h

85

68

60Glucoseconsumptionrate/(g/(Lžh))1.141.561.97w

(Glucoseconversion)/%

90.0

88.9

94.9r

(Pyruvate)/(g/L)

77.3

69.0

57.2Productivity/(g/(Lžh))

0.91

1.01

0.95Yp/s

/(g/g)0.7240.6490.483d

(DCW)/(g/L)

13.2

14.5

15.6Averagem

ofthefirst16h/h-1

0.238

0.190

0.139Averagem

oftheprocess/h-1

0.047

0.073

0.084r

(NH4Clconsumption)/(g/L)

5.66

5.88

6.06r

(KH2PO4

consumtion)/(g/L)

1.35

1.23

1.12r

(Ethanol)/(g/L)

1.34

1.55

1.67不同供氧控制模式下发酵过程参数高溶氧下，丙酮酸产率较高(0.724g/g)，葡萄糖消耗速度(生产强度)较慢(1.14g/(Lh))低溶氧下，细胞消耗葡萄糖速度加快(1.97g/(Lh))，丙酮酸产率(0.483g/g)却明显下降不同供氧控制模式下发酵过程参数丙酮酸产率细胞产率发酵法生产丙酮酸代谢网络分析DO=10%DO=85%高溶氧下转化率高的原因:DO从85%到10%，PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸代谢的通量下降了63.3%辅因子分析低溶氧下生产强度提高原因：DO从85%到10%，总ATP、NADH下降31.4%、18.6%，糖耗速度上升59%总ATP下降31.4%,NADH下降18.6%生产强度(糖耗速度)DO=10%DO=85%采用单一供氧模式(高或低)，不能同时达到高转化率和高生产强度发酵法生产丙酮酸实现相对统一高产量(69.4g/L)高产率(0.636g/g)高生产强度(1.95g/(Lh))

分阶段供氧模式发酵0-16h控制kLa为450h-1发酵16h后将kLa降低至200h-1发酵过程碳平衡分析前16h较高溶氧有利于碳流合成细胞；16h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸必须进行分阶段溶氧控制！如何分阶段？发酵法生产丙酮酸美国科学院院士LO.Ingram在PNAS上的论文11次引用本团队丙酮酸高效合成的论文，并比较表明本团队获得了国际最高发酵水平。

2篇有关丙酮酸发酵微生物生理特性和优化技术的博士论文2009、2011年分别获发酵工程领域至今唯一的两篇全国优秀博士论文被世界上最大发酵公司之一日本味之素公司购买，为该公司从中国购买的唯一技术发酵法生产丙酮酸二.新型有机酸发酵研究进展－丙酸丙酸的应用及市场2012:260mlbs(117,936tonnes)化学法：2万/吨发酵法：6万/吨（食品安全）丙酸钙价格06年全球产量37.7万吨75%用于谷物和饲料防腐消费者热衷于使用天然、绿色、健康的发酵级丙酸钙作为食品防腐剂化学合成法微生物发酵法烃氧化法、乙烯羰基化法食品安全问题原料廉价、可再生过程绿色、环保环境污染严重资源不可再生微生物发酵法——低碳、环保、绿色、安全!丙酸的生产方法丙酸杆菌代谢工程改造策略过量表达甘油脱氢酶（gldA），提高对甘油的利用速率过量表达苹果酸脱氢酶（mdh），富马酸水合酶（fumC），提高丙酸代谢途径通量gldAmdhfumC丙酸发酵的问题丙酸杆菌对碳源利用率低，生长慢；代谢途径过程中存在若干限速酶，大大抑制了丙酸的积累筛选丙酸高产菌从奶制品厂取样低丙酸浓度富集高丙酸浓度初筛产量检测复筛242529303236菌种鉴定筛选野生型质粒细胞壁裂解条件优化

Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result---++++--条件:溶菌酶20mg/mL37oC,蛋白酶K2mg/mL56oC.“-”表示细胞壁没有裂解.“+”表示细胞壁被裂解.菌种是否含有质粒P.a×25×32√29×30×24×36×质粒电泳图质粒鉴定分析质粒ORF转录水平分析丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析过量表达甘油脱氢酶电转化241000菌落PCR菌种鉴定Marker100012Marker151110001235371000Marker100012野生菌与工程菌分批发酵对比△:丙酸(PA),□:甘油浓度,▲:细胞干重(DCW),■:乙酸(AA),◆:琥珀酸(SA),ӿ:甘油脱氢酶比酶活.2929(pZGX03-gldA)菌株PA(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生产强度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20过量表达甘油脱氢酶工程菌的丙酸产量比野生菌提高了28%过量表达丙酸代谢限速酶GenomeofKlebsiellapneumoniaeBluntingligationBluntingligationmdhfumCP.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)和P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)分批补料发酵□,glycerol;△,PA;▲,LA;■,DCW;◆,AA.富马酸水合酶基因和苹果酸脱氢酶基因表达载体的构建过量表达丙酸代谢限速酶菌株周期(h)DCW(g/L)副产物(g/L)生产强度(g∙L-1∙h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA)2283.4134.622.862.600.15228.46P.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)2283.3434.522.832.570.15628.09P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)2283.3536.092.702.510.16433.91不同菌株丙酸发酵参数对比过量表达甘油脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了28.46%过量表达富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了28.09%过量表达苹果酸脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了33.91%共表达关键限速酶mdh-fumCElectrotransformation富马酸水合酶基因和苹果酸脱氢酶基因共表达载体的构建示意图三株共表达载体pZGX04-gldA-mdh,pZGX04-gldA-fumC,pZGX04-mdh-fumC的物理图谱共表达关键限速酶不同菌株丙酸分批发酵参数对比共表达苹果酸脱氢酶和富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了36.73%共表达甘油脱氢酶和富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了39.22%共表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了46.31%菌株周期(h)DCW(g/L)副产物(g/L)生产强度(g∙L-1∙h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh-fumC)2283.1636.852.652.330.16236.73P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-fumC)2283.2637.522.852.510.16539.22P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-mdh)2283.2839.432.742.550.17346.31氧化还原电位（ORP）发酵优化不控制ORP分批发酵□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸;

，ORP.不控制ORP发酵，ORP下降迅速，后期产酸能力低氧化还原电位（ORP）发酵优化不同ORP对分批发酵的影响□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸高ORP条件下，菌体浓度高；低ORP条件下，单位菌体产酸能力高氧化还原电位（ORP）发酵优化三阶段ORP控制对分批发酵的影响□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸提出三阶段ORP控制策略：0-36h，控制ORP为-200mV；36-156h，控制ORP为350mV，156h后控制ORP为-400mV。三阶段ORP控制分批发酵丙酸产量比不控制ORP发酵提高了27.7%10m3发酵罐放大试验丙酸10m3罐中试发酵过程曲线—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA丙酸最高产量为47.28g/L，生产强度为0.197g·L-1h-1全球第二家采用发酵法生产丙酸二.新型有机酸发酵研究进展－α-酮戊二酸

-酮戊二酸的应用降低病患机体损耗清除自由基，延缓衰老提高繁殖率，促进骨骼的生长有机中间体体格增强剂、运动饮料添加剂医药化妆品食品化工饲料

-酮戊二酸市场概况国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量约为1万吨

名称价格(RMB/Kg)纯度用途-酮戊二酸28098%医药、化工中间体L-精氨酸：-酮戊二酸钠盐(2:1)35099%运动饮料添加剂L-鸟氨酸：-酮戊二酸钠盐(1:1)65099%运动饮料添加剂化学法发酵法筛选得到的菌种：解脂亚诺酵母

-酮戊二酸的生产方法生产效率低、环境非友好和有毒试剂使用，限制其在医药、保健品和食品等高附加值产品生产应用生产效率高环境友好食品安全性高食品安全级生物法生产-酮戊二酸土壤样品维生素B1缺陷型筛选500株微生物菌株0.1g/L13.4%0.1-1g/L74.4%1-10g/L6.4%10g/L5.8%菌落形态AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG18SrRNAYarrowialipolyticaWSH-Z06生物法生产-酮戊二酸的关键问题当以甘油为唯一碳源时，发酵6天后-KG产量可达30g/L左右，但是发酵液中同时会积累大量的副产物—丙酮酸(30g/L左右)。Y.lipolyticaWSH-Z06摇瓶发酵曲线-KG(■),Glycerol(●),Pyruvate(▲),DCW(▼)

存在的问题1.辅因子调控3.节流2.开源4.调控转运蛋白解决方案——代谢工程改造解脂亚洛酵母代谢工程改造解脂亚洛酵母1.辅因子调控调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累CONACS1/ACLCONACS1ACL过量表达ACS1基因使胞内ACS比酶活达到0.92U/mgprotein，过量表达ACL基因使胞内ACL酶活达到了1.51U/mgprotein，比对照分别提高了10.5和11.6倍，胞内乙酰辅酶A含量分别是对照的231.2%和244.2%。调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累过量表达ACS1和ACL基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响■:-KG;●:Glycerol;▲:pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACS1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACL.提高16.2%提高28.6%Y.lipolytica-ACS1和Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸的产量分别为42.2g/L和46.7g/L，比对照菌(36.3g/L)分别提高了16.2%和28.6%。丙酮酸产量分别为14.5g/L和10.6g/L，比对照菌(21.2g/L)分别降低了31.6%和50%。代谢工程改造解脂亚洛酵母2.开源强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累6.5倍10.2倍CONScPYC1RoPYC2表达载体p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的构建Y.lipolytica及其突变株胞内PC酶活转化子提取基因组进行PCR验证强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累过量表达ScPYC1和RoPYC2基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响■:-KG;●:Glycerol;▲:Pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ScPYC1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-RoPYC2.Y.lipolytica-ScPYC1和Y.lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的产量分别为45.2g/L和49.1g/L，比对照菌(36.3g/L)分别提高了24.5%和35.3%。丙酮酸产量分别为10.2g/L和6.4g/L，比对照菌(21.2g/L)分别降低了51.9%和69.8%。提高24.5%提高35.3%5M3中试结