课题分解纤维素的细菌的分离

专题二微生物的培养与应用课题3分解纤维素的微生物的分离生物选修1㈠纤维素与纤维素酶1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。一、基础知识棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？

纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纤维素①取二支20mL的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验②各加入一张滤纸条③各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸－醋酸钠缓冲液11ml和10ml甲乙④在乙试管中加入1mL纤维素酶⑤两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h⑥结果：乙试管的滤纸条消失

讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？刚果红染色法

刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

（二）纤维素分解菌的筛选

当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。二、实验设计实验方案：土壤取样选择培养梯度稀释将样品涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上筛选产生透明圈的菌落①分布环境1、土壤取样：富含纤维素的环境中操作步骤

由于生物适应一定的环境，环境对生物有选择作用，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②原因③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。2、选择培养

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。

①目的：说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。培养基成分分析培养基组成提供主要的营养物质纤维素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、无机盐KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g无机盐酵母膏0.5g生长因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至1000mL水提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。2、选择培养②制备选择培养基：A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？P29旁栏思考按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101～107倍。3.梯度稀释4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上⑴制备鉴别培养基:配方见书本29页。操作过程见课题1（2）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。5.刚果红染色法方法一：先

，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在

时就加入刚果红。培养微生物倒平板这两种方法各有哪些优点与不足？染色法优点缺点方法一方法二颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂操作简便不存在菌落混杂问题1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。P29旁栏思考题方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯化培养。6、纯化培养四、结果分析与评价

1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2.分离的结果是否一致

由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。分解纤维素的微生物的分离纤维素酶种类、作用、催化活力刚果红染色筛选原理实验设计土壤取样选择培养涂布培养纯化培养前置染色法后置染色法富含纤维素土壤增大分解菌含量染色鉴别分离出分解菌课堂总结1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是（）A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖D课堂练习2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是（）A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛

选出了纤维素分解菌BD3.纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有()A．NaNO3B．KCl

C．酵母膏D．纤维素粉C4.刚果红染色时，加入刚果红可在()①制备培养基时②梯度稀释时③倒平板时④涂布时⑤培养基上长出菌落时

A．①③B．②⑤

C．③⑤D．④⑤5．分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是(

)A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B．富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少C．经稀释培养后，用刚果红染色D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上解析：经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物.A6．下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答有关问题：(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明___________________。根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基如下，整个实验过程严格执行无菌操作。如果将其中的纤维素粉换成________，菌落数____________________________，即可说明选择培养基的作用。纤维素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO45g1g1.2g0.9gMgSO4·7H2OKCl酵母膏、水解酪素0.5g0.5g适量葡萄糖明显多于选择培养基上的菌落数(3)接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，本实验宜采用________法，原因是________________________________________________________________________。稀释涂布平板平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数7.有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题：(1)培养基中加入的化合物A是________，为微生物的生长提供________，这种培养基从用途上进行分类，应属于________培养基。(2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，还应向培养基中加入________。(3)若用平板划线法获得纯净的菌株，请回答：①在接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都