临床免疫学和免疫检验第六章 沉淀反应讲义

第六章沉淀反应沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象第一节沉淀反应的特点沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见;第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。第二节液体内沉淀试验_、絮状沉淀试验抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响因此常用来作为测定抗原抗体反应最适比例的方法，常见类型有：一）抗原稀释法抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。二）抗体稀释法抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。三）方阵滴定法方阵滴定法即棋盘滴定法。二、免疫浊度测定属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器与自动化检测系统相结合应用于沉淀反应，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。（一）免疫比浊测定的影响因素1•抗原抗体的比例是浊度形成的关键因素。当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少，这就是高剂量钩状效应。当抗体过量时,IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。在反应体系中保持抗体适当过量，如形成抗原过量则造成测定的准确性降低。2•抗体的质量对免疫比浊测定法的抗体要求（1） 特异性强（2） 效价高（3） 亲和力强:则抗体的活性高，不仅可以加快抗原抗体反应的速度，而且形成的IC较牢固，不易发生解离。在速率比浊法中尤为重要。（4） R型和H型抗体：根据抗血清来源的动物种类不同，分为R型抗体和H型抗体。R型抗体是指以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清。这类抗血清的特点是亲和力较强，抗原抗体结合后不易发生解离。H型抗体是指以马为代表的大型动物注射抗原后制备的抗血清,这类抗血清的亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离抗原抗体反应的溶液反应液最适pH为6.5〜8.5,否则不易形成IC，甚至可引起IC解离。在一定范围内，离子强度大，IC形成越快：离子的种类也可影响IC的形成。一般常使用磷酸盐缓冲液作为免疫比浊法的反应液。增浊剂某些非离子型亲水剂对促进IC的形成有显著的增强作用，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20,其作用是消除蛋白质（抗原或抗体）分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。（二） 免疫比浊法方法分类1•透射免疫比浊法通过检测光被吸收、衍射、反射和折射后光线减弱的变化，来定量抗原抗体的复合物。2•免疫胶乳比浊法是以胶乳作为载体对小分子免疫复合物进行微量测定，进一步提高了免疫浊度测定的灵敏度。散射免疫比浊法通过检测光折射和衍射而形成的散射光强度来定量抗原抗体的复合物。该法根据抗原抗体反应的时间和反应结合的动力学，又可分为终点散射比浊法、固定时间散射比浊法和速率散射比浊法。（三） 免疫比浊法应用血液、体液中蛋白质的测定如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、补体C3、补体C4、血浆蛋白（前白蛋白、a-抗胰蛋白酶、a-酸性糖蛋白、a2-巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合球蛋白、转铁蛋白）。尿微量蛋白系列和半抗原（如激素、毒物和各种治疗性药物）。（四） 免疫比浊法优点稳定性好敏感度高（达ng/L）3•精确度高（CVV5%）简便快速，易于自动化无放射性核素污染，适合于大批量标本的检测第三节凝胶内沉淀试验利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，借此可用以识别不同待测物分子量的差别。一、单向扩散试验在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。（一） 试管法将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。较少采用。（二） 平板法是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖凝胶内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37卫让其自由扩散，24〜48小时后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。有两种计算方法：Mancini曲线适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果，沉淀环直径的平方®）与抗原浓度（c）呈线性关系：c/d2=k。Fahey曲线适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理,用半对数纸画线，浓度对数logc与扩散环直径（d）呈线性关系：logc/d=k（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）。（三） 影响因素抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。每次测定都必须作标准曲线。每次测定时必须用质控血清作质控。注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。二、双向扩散试验双向扩散试验是让抗原和抗体在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成沉淀线，沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。双向扩散试验简单易行，用途广泛，但该技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。（一） 试管法（二） 平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。根据沉淀线的有无、形态和位置可作如下分析：抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计（1） 沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大（2） 沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大（3） 不出现沉淀线则表明无对应的抗体（抗原）或者抗原过量抗原或抗体相对分子量的分析（1） 抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。分子量小者扩散快，反之则较風（2） 由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方；如果两者分子量大致相等，则形成直线。抗原性质的分析（1） 两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀,两个抗原相同（2） 沉淀线呈部分相切，说明两个抗原之间有部分相同（3）两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同抗体效价的滴定双向扩散试验是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原和抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价。抗原或抗体纯度鉴定用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条沉淀线说明不纯。双向扩散试验简单易行，用途广泛，但该技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。第四节免疫电泳技术电泳分析与沉淀反应的结合产物。一、优点（一）加快了沉淀反应的速度；（二）电场规定了抗原抗体的扩散方向，使其集中，提高了灵敏度；（三）可将某些蛋白组分根据其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。本法既具有抗原抗体反应的高度特异性，又具有电泳技术的高分辨率和快速、微量等特性，因此其应用范围日益扩大。随着实验技术的不断发展，免疫电泳技术逐步发展为对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等多项实验技术，广泛用于科学研究和临床实验诊断分析。二、对流免疫电泳双向免疫扩散与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。在pH8.6缓冲液中，大多蛋白质带强负电荷，在电场中向正极移动；而IgG等电点偏高（pH6〜7）,在辿时带负电荷较少，且分子量较大，移动速度慢，故向正极移动缓慢甚至不移动。在凝胶的电渗作用下，随水流向负极，电渗引向负极移动的液流速度超过了IgG向正极的移动速度，因此抗体移向负极，在抗原抗体最适比处形成沉淀线。IgG作为蛋白质在电泳中比较特殊，4个亚型有不同的表现，IgG3和IgG4与一般蛋白质无异，泳向正极，而IgGl和IgG2则因其带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，所以被水分子挟裹向负极移动。这就形成了IgG的特殊电泳形式：一部分泳向正极，另一部分泳向负极，在抗体孔两侧都有抗体存在，因此所谓对流只是部分IgG的电渗作用所致三、火箭免疫电泳单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，实质上是加速的单向扩散试验。实验时，将抗体混合于琼脂中，样品孔中的抗原置于负极端，电泳时抗体不移动，抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少,抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。当琼脂中抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关，因此用已知标准抗原作对照，抗原浓度为横坐标，峰的高度为纵坐标，绘制标准曲线，待测样品浓度就可根据沉淀峰的高度在标准曲线中计算获得。火箭电泳作为抗原定量只能测定Pg/ml以上的含量，如低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。加入少量125标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰，经洗涤干燥后，用X线胶片显影，可出现放射显影，这就是目前采用的免疫自显影技术，根据自显影火箭峰降低的程度（竞争法）可计算出抗原的浓度。免疫自显影技术可测出ng/ml的抗原浓度。四、 免疫电泳区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫分析技术，为定性试验。先用区带电泳技术将抗原在凝胶中电泳，分成肉眼不可见的若干区带，电泳停止后，沿电泳方向挖一与之乎行的抗体槽，加入相应抗血清，置室温37°C作双向扩散，经18〜24小时后，已分离成区带的各种抗原成分与抗体槽中相应抗体在两者比例适合处形成弧形沉淀线。免疫电泳所需扩散时间长，沉淀线的数目和分辨率又受许多因素影响，且结果较难分析，必须积累经验，才能作出恰当的结论。免疫电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定方面，例如多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。五、 免疫固定电泳可用于各种蛋白质的鉴定。该方法原理是先将待检样品在凝胶板上作区带电泳，将蛋白质分离成不同区带，然后在其上覆盖抗血清，当抗血清与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合，便形成抗原抗体复合物而沉淀。最后通过漂洗和染色，并与蛋白质参考泳道对照分析，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。本法可用于迁移率近似的蛋白和M蛋白的鉴定与分型，免疫球蛋白轻链，尿液中的本-周蛋白检测及k、入分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型，鉴定游离轻链，补体裂解产物等。免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。六、 交叉免疫电泳将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术。是一种有效的抗原蛋白定量技术，可一次同时对多种抗原定量。分辨率较高，有利于各种蛋白组分的比较，对于蛋白质遗传多态性、微小异质性、蛋白质裂解产物和不正常片段等进行定性分析。（1〜4题共用答案）带现象前带后带等价带拖尾现象沉淀反应中抗原过量的现象称为『正确答案』C『答案解析』沉淀反应中抗原过量的现象称为后带。沉淀反应中抗体过量的现象称为『正确答案』B『答案解析』沉淀反应中抗体过量的现象称为前带。沉淀反应的反应曲线中，抗原抗体分子比例合适的范围称为『正确答案』D『答案解析』沉淀反应的反应曲线中，抗原抗体分子比例合适的范围称为等价带。沉淀反应的反应曲线中，抗原或抗体极度过剩而引起无沉淀物形成的现象称为『正确答案』A『答案解析』沉淀反应的反应曲线中，抗原或抗体极度过剩而引起无沉淀物形成的现象称为带现象。沉淀反应的抗原是颗粒性抗原可溶性抗原半抗原超抗原致敏抗原『正确答案』B『答案解析』沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合时出现的沉淀现象。关于免疫浊度法测定错误的是反应液中抗体过量反应液中抗原过量反应液中抗原、抗体比例合适常用聚乙二醇等增浊剂通常用磷酸盐反应液『正确答案』B『答案解析』当抗原过量时，形成的IC分子小，而且会发生再解离，使浊度反而下降，光散射亦减少,这就是高剂量钩状效应。下列有关沉淀反应第一阶段的说法，错误的是抗原抗体的特异性结合几秒钟至几分钟内即完成可用散射比浊测定反应结果出现肉眼可见的沉淀线或沉淀环肉眼见不到免疫复合物『正确答案』D『答案解析』沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小的复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。免疫沉淀反应常用于颗粒性抗原检测抗原抗体的结合瞬间肉眼可见用于可溶性抗原的检测不能用于定量检测可不考虑抗原抗体的比例『正确答案』C『答案解析』免疫沉淀反应用于可溶性抗原的检测。关于单向扩散实验错误的是需先将抗原混入琼脂内有试管法和平板法需先将抗体混入琼脂内可用于定量检测抗原抗体的比例合适处形成沉淀环『正确答案』A『答案解析』单向扩散试验是在琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。有试管法和平板法。通过观察双向琼脂扩散试验的结果，不能解决的问题是是否存在相应的抗原或抗体抗原和抗体相对含量的估计抗原和抗体相对分子量的分析判断两种抗原的性质是否相同抗体浓度的确定『正确答案』E『答案解析』双向扩散试验是让抗原和抗体双方都在琼脂中各自向对方扩散，在比例恰当之处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。根据试验形式也可分为试管法和平板法两种。（一） 试管法（二） 平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一。根据沉淀线的有无、形态和位置可作如下分析：抗原或抗体的存在与否以及相对含量的估计。抗原或抗体相对分子量的分析。抗原性质的分析。抗体效价的滴定。抗原或抗体纯度鉴定。免疫电泳的影响因素不包括电场强度溶液pH离子强度抗体纯度电渗『正确答案』D『答案解析』免疫电泳的影响因素不包括抗体纯度。单向扩散试验时错误的是将一定量的抗体混入琼脂中每次测定必须做标准曲线不必每次测定都做标准曲线将抗原加入所打的孔中24〜48小时看结果『正确答案』C『答案解析』单向扩散试验时错误的是：不必每次测定都做标准曲线。双向琼脂扩散试验中，若抗原的含量比抗体多且分子量比抗体小，则沉淀线应为靠近抗原孔，且弧线弯向抗原侧靠近抗原孔，且弧线弯向抗体侧靠近抗体孔，且弧线弯向抗原侧靠近抗体孔，且弧线弯向抗体侧居于抗原抗体孔中间，且弧线弯向抗原侧『正确答案』D『答案解析』沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致，沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大；沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大；不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原或者抗原过量。抗原或抗体相对分子量的分析抗原或抗体