课件教程讲稿

修饰设计：使用penoeTMkit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下不一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。（1）3MNaOH（用前现配把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意谨慎和实验作（2）20mMNaOH/90%EtOH（用前现配溶解试剂Ⅰ（用前现配打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227gDNA修饰试剂Ⅰ加入0571L水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20l3MNaOH调整pH至50，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。溶解试剂Ⅱ打开前将试剂瓶加温至室温。将1μlβ-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰DNA750μl1.35gDNA的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。第二步：DNA修饰程序1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl3MNaOH加入到含有DNA1.0μgDNA2μlDNA剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl3MNaOH并混匀。3550μl新鲜配制的DNA 强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。用10x的1mL塑料秱液管枪头来回吸排悬液2 向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ3 加入750μlDNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀4 室温孵育5-10分钟 5000Xg离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。（应出现一种白色的小颗粒。） 加入1.0mL70%的乙醇，涡旋振荡，5000Xg离心10秒，弃去上清。该步骤重复进行，共3次。7 将第三次上清弃去后，离心管高速离 分钟，用塑料秱液管枪头秱去剩余清第四步：完成 修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱1 适量样本加入50μl20mMNaOH/90%EtOH溶液2 充分涡旋振荡悬浮颗粒，再室温孵育5分钟3 4、第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟5、用塑料秱液管头除去所有剩余上清。试管室温10-20钟（必须除去6、加入TETEDNA25μlTE1μgDNA40ng/μl。7、50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA8、高速离心2-3分钟并用塑料秱液管头转秱样本（上清）到新管。9、进行MSP或，或-15～-25℃可保存达2个月，-80℃可保存6个月。避免重复融化和解冻；可分量。丌要将DNA在自动除霜冰箱。 当从一管中转秱已解冻的DNA以备用时避免将试剂Ⅲ转秱到PCR反应管中。三、（1）运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物，引物由生物工表表 甲基化引物序列及扩增条hMLH1引 引物序列温甲基化(M)正 115甲基化(M)反 115非甲基化(U)正 124非甲基化(U)反 124（2）PCRa10×PCR5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分别为1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至总体积50μl。b循环条件：程温时60变30退3060 产物结果判定：琼脂糖凝胶电泳甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断，则判断启动子区5’pG岛甲基化阳性。甲基化：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断。则判断启动子区5’pG岛甲基化。生物实 ，细胞、分子生物学、蛋白检测技术实点击进 点击进入淘宝生物实验，细胞、分子生物学、蛋白检测技术实验，约7G大小，22本套实验制作耗资上百万，由专业的影视和后期制作团队拍摄+生物、医学领域的教授专家指导+Thermo、oche等著名企业参与共同制作完成。分子生物学实验技术共6个，包括:DNA甲基化检测、分子克隆技术、高分辨溶解曲线（HRMPCRQPCR（ISH蛋白检测技术共6个，包括:TUNEL法检测细胞凋亡、酶联接免疫吸附测定（ELISA免疫印迹法（Westernbotting、免疫组化（IHC、凝胶迁移实验（EMSA、染色质免疫沉淀技术（Ch