分光光度计和流式细胞仪介绍

吸光分光光度计

在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:

红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。

紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。

可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm，主要用于有色物质的定量分析。

紫外可见吸收光谱1．光的基本性质

光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述：

=c

；波数=1/=/c

光是由光子流组成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常数：h=6.626×10-34J×S)

光的波长越短（频率越高），其能量越大。白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光

单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成)

可见光区：400-750nm

紫外光区：近紫外区200-400nm

远紫外区10-200nm（真空紫外区）2.物质对光的选择性吸收及吸收曲线M+热M+荧光或磷光

E=E2-

E1=h

量子化；选择性吸收;

分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；

M+

h

M*基态激发态E1

（△E）E2吸收曲线的讨论：（1）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。

（2）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。（3）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。光的吸收定律朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c

二者的结合称为朗伯—比耳定律朗伯—比耳定律数学表达式

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；

ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c’：溶液的浓度，单位g·L－１

a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１

a与ε的关系为：

a=ε/M

（M为摩尔质量）透光度(透光率)T透过度T:描述入射光透过溶液的程度:

T=It/I0吸光度A与透光度T的关系:

A

＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；流式细胞术的基本概念流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。散射光信号

当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。散射光信号RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

细胞相对大小及其表面积

侧向角散射光（SSC,SideScatter）

细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性前向角散射光信号侧向角散射光信号外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）

颗粒杂质、气泡对检测的影响荧光信号