动物细胞培养的基本技术

动物细胞培养姓名：李健专业：生物化学与分子生物学目录细胞培养室的设置、设备和准备工作细胞培养总原则无菌操作技术及常规实验操作方法1.2细胞培养室的设置、设备和准备工作一、细胞培养的必备设施无菌实验室超净工作台恒温培养箱其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）无菌实验室⑴设计原则：防治微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘。⑵组成：更衣间：放在外，供更换衣帽、鞋子等之用。缓冲间：位于更衣间与操作间之间，也可同时与几个操作间相通。操作间：放在内间，供无菌操作和细胞培养，房间不受日光直射，大小适宜，高2.5m。超净工作台分类侧流式：气流由左侧或右侧通过台面流向对侧直流式：气流从上向下或从下向上流动外流式：气流向操作者方向吹来注意事项：使用前半小时先开紫外线灯灭菌，再关灭菌灯启动风机，然后进行操作。使用后用75％的酒精擦洗台面。

切记：不要用有机溶剂擦拭挡风玻璃。恒温培养箱变通电热恒温培养箱

CO2培养箱37℃，饱和湿度，5％CO2其他设备酶标仪二、细胞培养常用器材及处理方法玻璃器材塑料器材橡皮器材金属器材其他用品玻璃器材常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管。首次使用：重复使用的处理步骤：自来水刷洗0.1％稀盐酸浸泡过夜自来水冲洗自来水刷洗硫酸－重铬酸钾浸泡过夜自来水冲洗10次双蒸水冲洗2次单蒸水冲洗3次晾干、包装121℃高压蒸汽灭菌20min塑料器材

常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、

12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸头。重复使用的处理步骤：自来水刷洗3％HCl或2％NaOH溶液浸泡过夜自来水充分冲洗双蒸水冲洗3次紫外线直接照射或辐照灭菌橡皮器材首次使用：自来水刷洗5％NaOH溶液煮沸15min自来水冲洗8次4％HCl盐酸煮沸15min自来水冲洗8次双蒸水冲洗1次单蒸水冲洗3次晾干、包装121℃高压蒸汽灭菌20min

重复使用的处理步骤：注意：橡胶器材需用铝铂包装，放在铝盒内高压蒸汽灭菌。自来水刷洗洗衣粉加热煮沸10min自来水充分冲洗单蒸水冲洗3次蒸馏水煮沸2次，每次15min晾干、包装121℃高压蒸汽灭菌20min双蒸水冲洗1次其他用品

缓冲液（PBS）：高压蒸汽消毒

血清：56℃水浴灭活30min

合成培养基：过滤除菌（0.22μm、0.45μm）常见消毒法的适应对象紫外线消毒电离辐射消毒高压蒸汽消毒干热消毒过滤除菌化学灭菌法适应对象不适应对象空气、台面、不适于用其它方法消毒的器皿试剂、培养液适于大量消毒且不适于用高压、过滤消毒的器皿活的生物材料适于绝大多数器皿试剂玻璃器皿活的生物材料易燃、挥发性物质金属、橡胶、塑料制品遇热易变性、失效试剂和培养液含大分子物质量高的试剂不能用物理法除菌的物品场所培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃,15磅,20分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时。常用物品消毒压力及时间无菌无毒害的环境1支持生长增殖的营养2其它类似体内的环境3维持细胞性状4

细胞培养总原则(一)细胞培养无菌无毒环境实验室设计合理常用设施及设备培养器皿：透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。细胞培养无菌操作基本技术工作环境及表面的处理细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理培养液与培养细胞的处理(二)细胞的营养培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。其它成分（条件培养基）合成培养基的主要成分氨基酸碳水化合物无机盐维生素其它辅助物质培养基种类RPMI-1640（标准型）DMEM-高糖（标准型）DMEM-低糖（标准型）McCoys5AM199F12血清牛血清、马血清、人血清（1）储存于-20℃—-70℃低温冰箱中（2）一般厂商提供的血清为无菌（3）热灭活是指56℃,30分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complement）灭活（4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理。血清的主要作用

⑴提供基本营养物质

⑵提供贴壁和扩展因子（FN、LN）

⑶提供激素及各种生长因子（FGF、EGF、PDGF)

⑷提供结合蛋白（中和代谢产物及蛋白分解酶等细胞障碍因素）

⑸对培养中的细胞提供某些保护作用注意点：

血清型号、种类不同，所含营养因素有差别，不可忽视；在需要观察细胞某种特性时，血清使问题变复杂，要除去。血清的使用与储存

使用前的处理

56℃灭活30min→去除补体成分

（趋势：大部分细胞培养不需灭活；需要灭活的：巨噬细胞、肥大细胞、血小板、淋巴细胞等）

储存条件

灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），－20℃储存；使用前4℃融化。

使用浓度

一般为5％～20％，最常用的是10％。其它常用液体试剂⑴Hank’s⑵D-Hank’s⑶PBS⑷NaHCO3（7.5%

）⑸胰酶溶液（0.25%）0.01MPBS*(pH7.4,高压灭菌)组分含量(g/L)NaCl8.0KCl0.2Na2HPO4Na2HPO4•7H2ONa2HPO4•12H2O1.442.683.58KH2PO40.24H2O1000

缓冲液1×PBS(Phosphate-BufferedSallines)

消化液⑴作用：分离组织和分散细胞⑵常用消化液：胰蛋白酶二乙胺四乙酸二钠(EDTA)⑶通常使用浓度:0.25%Trypsin:0.25ginPBS0.02%-0.03%EDTA:0.02-0.03gEDTApH:7.4；过滤；-20℃保存胰蛋白酶(简称胰酶)：黄白色粉末，易潮解，冷暗干燥处保存，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制。目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰腺胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，离散细胞胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰酶简介胰蛋白酶胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。通常：胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液可终止其对细胞的消化作用。

胰蛋白酶EDTA是一种化学螯合剂，对细胞毒性小，价格低廉，使用方便。通常与胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，浓度见前面。注意：使用EDTA处理细胞后，一定要用Hanks液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长。

EDTA·4Na溶液(三)其它类似体内的环境温度气体渗透压氢离子浓度(PH)其他(四)合理的计划，维持细胞性状

尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复的细胞以及转染后稳定存在的细胞。需要做实验的细胞要选对数生长期。防止细胞污染，如遇污染，及时处理。无菌操作技术体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。

【操作前消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。【火焰消毒】

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

1.紫外灭菌：实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2.无菌操作：

无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作常识3.

安全取用：小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。无菌操作常识85培养细胞的观察１．肉眼观察培养物颜色及混浊度２．倒置显微镜观察细胞生长状态细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数细胞计数：

1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法：1吸光培养瓶中的培养液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-5min（显微镜下动态监测）。3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。6吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。7加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。8将后者放入培养箱中培养。

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。培养细胞活力测定1．台盼蓝法

活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；

用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；

方法：

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；

2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

2．四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；

MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的蓝紫色产物（formazan)量成正比。再用酶标仪测定OD值；

MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长490纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。常规观察需每天观察细胞生长过程中出现的变化：1.培养液的颜色与透明度2.细胞形态变化3.

细胞生长状态4.微生物污染细胞冻存和复苏

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序标准程序：

当温度在-25℃以上时，1～2℃/min当温度达-25℃以下时，5～10℃/min当温度达-100℃时，可迅速放入