制备针对TK不同抗原表位的多克隆抗体,免疫学论文

制备针对TK不同抗原表位的多克隆抗体,免疫学论文人组织激肽释放酶(TK)作为人激肽释放酶-缓激肽(KKS)系统中的一个关键酶,能通过裂解低分子量激肽原释放缓激肽和激肽类物质,进而与血管壁和其他部位的内皮平滑肌细胞上的缓激肽受体2(B2)结合,激活一氧化氮-环磷酸腺苷(NO-cAMP)和前列环素-环磷酸腺苷(Prostacyclin-cAMP)等信号通路,触发一系列生物活性效应,包括血管舒张、平滑肌收缩和舒张、抑制凋亡、炎症、增殖、肥大和纤维化,及促进血管生成和神经发生等[1,2].由于B2受体广泛存在于人体内的组织及细胞中,如平滑肌细胞、神经细胞、肾小管上皮细胞和心肌细胞中[3],因而TK具有广泛的生物效应并可能在心脑血管疾病的发生发展中具有广泛的应用前景.本研究利用生物信息学预测TK蛋白可能的高级构造、亲水性和抗原性高低,根据分析结果,选取预测抗原性较高、与已经知道蛋白同源性低的多肽片段,将其免疫家兔,制备针对TK不同抗原表位的多克隆抗体,为TK检测试剂盒的制备以及进一步研究TK在心脑血管疾病发生发展的作用及机制奠定了基础.1材料与方式方法.1.1主要材料日本大耳白(2kg)购自华中科技.大学同济医学院实验中心;血蓝蛋白(KLH)、戊二醛、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏完全佐剂(FIA)、TMB购自Sigma公司;牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、HRP标记羊抗兔IgG购自武汉凌飞生物有限公司;抗体亲和层析试剂盒购自PIERCE公司;TK-4T1融合蛋白为本实验室生产[4];预染的蛋白质分子量标准购自Fermentas(MBI)公司;PVDF膜购自德国SchleicherSchuell公司;化学发光试剂ECL购自PIERCE公司;凝胶成像系统(GeneGeniusBioIma-gingSystem)为Synegene公司产品;Westernblot设备为Biorad公司产品.1.2生物信息学分析登录进入采用Blastn和Blastx程序,进行同源性检索和保守性分析.采用ProtScale程序、ExPASy工具包程序、SWISSPROT蛋白数据库和DNAstar(Protean)生物信息学软件对TK(KLK1)的二级构造、抗原性、亲疏水性、结合位点、氨基酸的带电性等理化性质进行分析.1.3TK多肽的设计与免疫原及包被原的合成.TK是位于人类染色体19q13.13~19q13.14上的一段丝氨酸蛋白酶(图1),由262个氨基酸组成.我们根据生物信息学分析和预测,按抗原性、亲疏水性和同源性分析,分别设计了位于TK头端的含11个氨基酸的多肽(11P:AC-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Thr-COOH)和位于TK尾端含12个氨基酸的多肽(12P:NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH)(图2).多肽的合成和纯化由西安美联公司完成(纯度为98%).首先称取10mg多肽溶于1mlPBS,取华而不实700l置于10ml试管中,分别参加1mlKLH及BSA,然后缓慢参加0.3%戊二醛,室温下振摇2h直至反响液变为黄色,参加1mmol/L甘氨酸125l终止反响.30min后将所有反响液体装入透析袋内,并将透析袋置于2LPBS中,在4℃充分透析,隔日更换PBS继续透析4h.分装包被原(11P-KLH;12P-KLH)及反响原(11P-BSA;12P-BSA),-20℃保存.1.4TK多克隆抗体的制备及纯化分别取多肽免疫原(11P-KLH;12P-KLH)与等量弗氏完全佐剂充分乳化,按300g/只的剂量对家兔进行背部皮内多点注射,3周后,将免疫原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化,并用同样的方式方法免疫小鼠,以后每隔3周免疫1次,共免疫3次.末次免疫后7d于耳缘静脉取血,试血达理想效价后颈动脉放血,收集兔血清并进行亲和层析纯化.1.5TK多克隆抗体效价及抗原表位分析利用间接ELISA法来测定TK兔抗血清的效价.以包被原为固相,参加倍比稀释的兔抗清及HRP标记的羊抗兔抗体,以1∶200稀释的正常兔血清作为阴性对照,应用间接ELISA方式方法以TMB为底物测定OD450nm值,以(被检标本值-空白对照值)/(阴性对照值-空白对照值)即P/N2.1为阳性.采用间接ELISA相加实验进行测定.以TK-4T1融合蛋白为抗原包被酶标板,前两孔分别参加上述两种多抗(抗11P及抗12P),其OD值分别记录为A1和A2,第3孔先以华而不实一种饱和量的多抗于37℃作用1h,洗涤后再与另一种多抗作用1h.洗涤后,参加HRP标记的羊抗鼠IgG,于37℃保温30min,洗涤后加TMB显色,A450值记录为A1+2,计算相加指数:AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]100%.每组做3个复孔,取其平均值.AI50%者,即以为这两种多抗辨别TK不同的抗原表位.1.6TK多克隆抗体的特异性及纯度检测我们将TK-4T1与纯化后的TK多克隆抗体行Westernblot检测以鉴定多克隆抗体的特异性.然后利用SDS检测多抗的纯化效果.2结果.2.1多肽抗体的制备和效价家兔免疫后获得的血清进行倍比稀释,以P/N,2.1为阳性,间接ELISA测定效价均达1∶25600以上,表示清楚获得高效价的多抗.2.2抗原表位分析经间接ELISA法检测,A1的均值为0.79,A2的均值为0.92,A(1+2)的均值为1.58;抗11P与抗12P的相加指数为0.85%,其值大于50%.因而抗11P与抗12P辨别不同的抗原表位.2.3多肽抗体的特异性为了检测兔血清的特异性,我们分别将TK-4T1融合蛋白和阴性对照PEGX-4T1转印至PVDF膜上,然后将分别将纯化后的抗体稀释到1∶8000倍进行Westernblot印迹分析,结果均显示转印至PVDF膜上的TK-4T1蛋白与免疫兔血清在Mr约55kD处构成单一阳性染色带,与TK-4T1蛋白分子量的理论值相符,而阴性对照处则无条带出现,表示清楚获得了抗TK的多克隆抗体(图3).2.4多肽抗体的纯度利用亲和层析法分别纯化了抗11P与抗12P,并采用回收的抗体样本做了SDS染色,结果均发现了清楚明晰的两条带(轻链和重链)且未见杂带.因而,该抗体的纯化率为100%(图4).3讨论.人组织激肽释放酶是一类丝氨酸蛋白酶,位于人类染色体19q13.13~19q13.14上,因编码不同的丝氨酸蛋白酶而具有不同的功能.人组织激肽释放酶由15个成员组成.人和动物的组织激肽释放酶中只要一种酶能有效地使激肽原释放生物活性物激肽即为TK[5].我们前期制备TK多抗的方式方法是采用构建原核表示出载体,在大肠杆菌中表示出并纯化图4TK多克隆抗体经亲和层析纯化后的SDAFig.4SDAofaffinitychromatographyforpoly-clonalantibodiesNote:M.Proteinmarker;1.Anti-11P;2.Anti-12P.融合蛋白(TK-4T1),随后免疫动物制备抗血清[4].鉴于利用融合蛋白制备抗体的经过繁琐,费时费力,特异性不理想,不利于我们进一步进行TK相关的临床研究.因而我们利用信息学在基因辨别、蛋白质功能预测、蛋白质生理范围确实定、蛋白质高级构造的预测等方面的重要作用来对TK的抗原性、跨膜构造域、二级构造、疏水性、结合位点、氨基酸的带电性、所选择氨基酸偏碱性和偏酸性及多肽的合成难易等进行分析[6].充分评估这些因素后我们选择了针对TK不同表位的两条多肽来制备针对TK不同表位的多克隆抗体.由于合成的多肽纯度均高达98%,并且是针对TK一段表位的,因而其可能具有较高的效价及纯度,并具有较强的特异性.我们的结果证实利用这两条肽段制备的多抗均具有较高的效价及较强的特异性,并且是针对TK不同表位的抗体,经纯化后,这两种抗体的纯度均为100%.这讲明我们的多抗制备是非常成功的.除此之外,由于这两种抗体是针对TK不同表位的,我们能够将这两种抗体应用于TK的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备及其他TK相关临床及基础研究.汪道文教授的团队及和LeeChao等人通过使用转基因的方式方法使激肽释放酶-激肽在体内的持续供给,发现KKS系统具有抗高血压,2型糖尿病的胰岛素抵抗的作用及通过抑制氧化应激来发挥心血管、肾脏和中枢神经系统的保卫作用[2,7].直接输注TK的基因或蛋白能够直接改善心功能、肾功能和神经功能而不伴有血压的降低.还有研究证明,过表示出的TK能减轻2糖尿病诱导的高血压和肾脏损害.除此之外,体外研究和动物实验均证明TK具有防护缺血性脑卒中的作用[2,9].我们前期的一项大规模的多中心研究亦证实血浆中TK的含量与脑卒中及其复发呈负相关关系,并且血浆中TK含量高的患者具有较长的无异常感觉和状态生存期[4].这一系列的研究进一步证实了TK在心脑血管及肾脏疾病的诊断和治疗方面可能具有广阔的应用前景,也讲明了开发TK相关产品的潜在应用价值.总之,我们通过合成肽来制备针对TK不同表位的多克隆抗体不仅提供了一种简便的行之有效的方式方法,还为TK相关产品的开发以及TK相关基础及临床研究提供了一定的实验基础.以下为参考文献:[1]TornelJ,MadridMI,Garcia-SalomM,etal.Roleofkininsinthecontrolofrenalpapillarybloodflow,pressurenatriuresis,andar-terialpressure[J].CircRes,2000,86(5):589-595.[2]ChaoJ,ChaoL.Kallikrein-kinininstroke,cardiovascularandre-naldisease[J].ExpPhysiol,2005,90(3):291-298.[3]RegoliD,RhalebNE,DrapeauG,etal.Kininreceptorsubtypes[J].JCardiovascPharmacol,1990,6:S30-S38.[4]ZhangQ,DingH,YanJ,etal.Plasmatissuekallikreinlevelisnegativelyassociatedwithincidentandrecurrentstroke:amulti-centercase-controlstudyinChina[J].AnnNeurol,2018,70(2):265-273.[5]HecquetC,TanF,MarcicBM,etal.HumanbradykininB(2)receptorisactivatedbykallikreinandotherserineproteases[J].Molecularpharmacology,2000,58(4):828-836.[6]BartlettGJ,ToddAE,ThorntonJM.Inferringproteinfunctionfromstructure[J].MethodsBiochemAnal,2003,44:387-407.[7]ZhaoC,WangP,XiaoX,etal.Genetherapywithhumantissuekallikreinreduceshypertensionandhyperinsulinemiainfructose-inducedhypertensiverats[J].Hypertension,2003,42(5):1026-1033.[8]XiaCF,YinH,YaoYY,etal.Kallikreinprotectsagainstischemicstrokebyinhibitinyapoptosisandinflammationandpromotinga