《离心层析电泳技术》

常用临床生物化学分析技术离心、层析、电泳技术

常用临床生物化学分析技术

主要介绍：

离心技术、层析技术、电泳技术，在临床生物化学中的应用及应该注意的基本知识

物质的分离技术最普遍使用的有三大类，即离心技术、层析技术、电泳技术。

它们是三项基本的实验室分离技术。一.离心技术：

简介：离心现象是指物体在离心力场中表现的沉降运动现象，应用离心沉降进行物质的分析和分离的技术称为离心技术。离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的作用而发展起来的。尤其在生化检验方面，离心机是分离细胞、细胞器和生物大分子如核酸、蛋白质等必不可少的工具。最简单的离心机由一个转头和一个驱动器组成，转头用来承载待处理的样品，驱动器则用来使转头以一定角速度作圆周运动以获得离心力。现代化的离心机再辅以各种附属装置以保证转头的工作质量，维持一定工作环境或特定目的，并广泛采用电脑控制。（一）.离心技术的分类1.根据离心方法分类：（1）.平衡离心法：①差速离心法：利用样品中各种组分的沉降系数不同而进行的分离方法。②速率区带离心法:：是根据样品中不同组分离子所具有的不同的体积尺寸大小和不同的沉降系数将混合样品进行离心分离提纯。.（2）.等密度离心法：又称等比重离心法，以离子密度进行分离。（3).经典式沉降平衡离心法：在分析离心方法中是最常用的，用于生物大分子分子量的测定、纯度估计、了解构象变化等。2.依据离心机转头的旋转速度分类：(1).低速离心：（4000r/min以内）(2).高速离心：（20000r/min，最大相对离心率可达45000g）(3).超速离心：（30000r/min以上，最大相对离心率达645000g）3.按照离心技术的实际应用分类：(1).普通离心(2).专用离心(3).制备型离心(4).分析型离心（二）.各类型离心机的特点和应用：1.低速离心机(1).锥形台式离心机：体积小、重量轻、容量大，能自动控制工作时间，操作简便，使用方便，适用于医院检验科，生物化学化验室等对样品的初级处理。(2).水平型桶式离心机(3).大容量立式离心机(4).带冷冻系统的大容量低速离心机2.高速离心机：由于运转速度快，一般多配备冷冻控温装置，适用于各种生物细胞、病毒、血浆蛋白等有机物、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液中有形成份的浓缩、提取、制备等工作，它是细胞生物学和分子生物水平研究的重要工具。3.超速离心机：（1）.制备型超速离心机：是临床医学、生物学、生物化学等研究领域重要仪器之一，利用高速回转所产生的巨大离心力对细胞器、病毒、生物大分子进行分离、浓缩和精致。（2）.分析型超速离心机：一般都装备有特殊设计的转头和控制系统，利用光学系统可直接观察和分析样品的沉降情况，利用特殊配备的数据处理机自动计算沉降系数、分子量。它主要用于生物大分子的分子量测定，评价样品纯度和检测生物大分子结构组态的变化等。（三）.操作中注意事项：普通医用离心机转速稍低，最常用，也最容易忽视安全，使用时必需每次做到：（1）.用前检查离心机电源开关，调速器等都应在起动状态（即每次用后应关好开关，退回调速器至起点）。（2）.平衡转头上相对两管至等重：水平转头常连套管在一起，在灵敏度0.1g的天平上平衡至等重，平衡时要检查套管内有无损伤或以前破管时残留物，否则要先洗净，以免再次引起破管。角度转头只能用配管平衡，不能在转头的插孔中随意加水或放空管去平衡。

使用高速和超速离心机必须严格按操作说明书操作！原则上应牢记，大型机一旦发生操作事故，必比普通机严重百倍！二.层析技术：（一）.简介：层析技术是一种现在已经广泛使用的物理化学分析法，是色层分析法或色谱分析法的简称。层析法目前已发展成许多不同类型而又各具特色的方法，层析用的各种仪器也由最简单的自制组合装置发展成各种现代化，全自动的数据处理系统的层析仪，广泛用于各种与化学有关的领域，特别是生物化学的研究中。(二).原理和分类:层析技术是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，各种层析方法都是利用物质在不互溶的两相之间，其吸附、溶解或亲和作用等理化性质上的差异，而将其从混合物中分离出来，加以鉴定的。其中一项称为流动相（或称移动相），另一项则称为固定项。根据两相的特点，常将层析分为两大类：流动相为液体的称为液相层析，流动相为气体的称为气相层析。层析随其层析过程的机制即原理不同，又分为以下几种：1.吸附层析：利用同一吸附剂对不同物质的吸附性能不同，可以在连续的吸附和解吸过程中达到使之分离的目的。其固定相就是固体的吸附剂。2.分配层析：利用不同物质在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，可以将它们分开。其固定相也是液体，但附着在其他固体惰性材料上。

3.离子交换层析：利用各种不同的离子型物质对离子交换剂的亲和力不同而加以分开。其固定相为各种离子交换剂。4.凝胶层析：利用某种凝胶对分子大小不同的物质有不同的阻滞作用（起到分子筛作用）能分开分子大小不同的物质。其固定相大多数是亲水凝胶。5.亲和层析：利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异性亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。实际上大多数层析都有吸附、分配过程，所以实用中仍常以操作时所采取的方式来命名。如柱层析（又叫加柱层析）、薄层层析、纸层析、薄膜层析等等。（三）.特点与应用:在层析法中,根据层析峰的位置及峰高或峰面积可以定性及定量。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。实际在原理及分类里大家已经知道各种层析法的特点，根据原理特点有其不同的应用：1.凝胶层析法：主要用于蛋白质及其他生物大分子物质的分离。如:①.脱盐：用于生化制剂脱盐，分离蛋白质。②.分离提纯精制：许多生化物质都可用凝胶层析法精制。③.测定高分子物质的分子量。④.高分子溶液的浓缩。2.离子交换层析法：在生物化学及临床生物化学检验中主要用于分离氨基酸、多肽、蛋白质及同工酶，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。3.高效液相层析法：分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行，应用范围极广，对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及高分子去聚合物分离尤为有利。鉴于临床的需要，国外一些公司设计了自动高效液相色谱仪，该仪器具有以下优点：①.固定色谱柱和流动相，使一台仪器适合多种药物的检测。②.利用计算机技术，储存几百种药物的图谱，能自动识别未知药物，为提高图谱鉴别能力，该机利用了三维光谱、出峰时间等多种手段。③.自动进样系统使仪器自动定量或定性测定分析多达50多个样品。4.亲和层析法：用于纯化生物大分子，稀溶液的浓缩，不稳定蛋白质的贮藏，从纯化的分子中除去残余污染物和用免疫吸附剂吸附纯化那些尚无互补配体的生物大分子以及分离核酸等如用亲和层析法提取特异性免疫球蛋白IgG等等。三.电泳技术：

[定义]：在电场中，带电粒子向所带电荷相反的电极移动的现象称为电泳。[简介]：电泳技术作为一种分离方法，已有数十年历史，特别是自1937年瑞典科学家建立了分离蛋白质的界面电泳，继而滤纸电泳研制成功后，各种形式的区带电泳相继出现，电泳技术在生物学和生物化学中被广泛应用。（一）.电泳技术的分类和特点：按原理分为三种形式的分离系统：1.自由.移动界面电泳：如密度梯度电泳等，现已成为历史。2.移态电泳：如等电聚焦和等速电泳。前两种不用支持体，后一种则用各种类型的物质作为支持体（支持介质）。3.区带电泳：根据固体支持体（介质）不同分为两类：（1）.纸上电泳、醋酸纤维素薄膜电泳等。（2）.第二类分两种：①.凝胶电泳：如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。②非凝胶电泳:如淀粉、纤维素粉等。

（二）.影响电泳的因素：在电泳中，电场、带电粒子、和促使带电粒子移动的介质是产生电泳的三大要素，因此影响电泳的主要因素有：（1）.颗粒性质：不同的带电粒子在同一电场中移动的速度不同，这一速度称迁移率。换言之，迁移率取决于带电粒子的性质，粒子所带电荷多，泳动速度就快。（2）.电场强度（也称电位梯度）：电场强度越高，带电粒子的泳动速度就越快。电场强度在2-10v/cm称为常压电泳电场强度在20-200v/cm称为高压电泳（3）.溶液的pH：影响带电粒子的解离程度，对两性电解质如蛋白质、氨基酸等pH离开等电点越远，所带电荷越多，泳动速度越快，若在等电点pH溶液中，则不能泳动，为保持电泳时pH恒定，电泳都在一定的缓冲液中进行。（4）.缓冲液的离子强度：一般保持在0.02-0.2之间，离子强度越小，泳动的速度越快。（5）.电渗：是指电场中液体对固体支持物的相对移动。在选用电泳支持物时，要考虑避免有高电渗作用的物质。（三）.区带电泳在临床、科研等领域的应用：目前电泳技术已广泛应用于临床诊断和基础理论研究中,如各级医院常常用它来进行血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白的分离、鉴定和含量测定，以及血清酶的检验、免疫化学检验等，作为诊断肝癌、肝硬化、恶性肿瘤、肾病综合症、多发性骨髓瘤等的诊断依据之一。在科研工作中利用高压电泳来研究蛋白质的一级结构等。在生化工业中用于提纯酶、激素及其他生化产品等等，总之，一系列与生物有关的物质（小至氨基酸，大至细胞）的鉴别、分离、提纯都离不开电泳技术。毛细管电泳：具有无法比拟的高效和快速性，因而受到极大重视，毛细管区带电泳已形成系列方法，以适应不同目的的需要：（1）.分析核酸：传统是以聚丙烯酰胺或琼脂糖作凝胶电泳分离，此法类似其但更快，用样量更少。（2）.分析PCR产物：聚合酶链式反应（PCR）是基因操作中一种体外扩增DNA的重要技术。（3).分离、分析多肽。(4).对小的生物分子的分离：毛细管电泳+分配层析技术称为分子束电层析，分离B族维生素，食物色素等等。

三类技术比较：物质的分离技术最普遍使用的有三大类，即层析技术、电泳技术和离心技术。它们是三项基本的实验室分离技术。这三类技术各有优缺点，相互补充。从分离原理来看，层析技术根据颗粒吸附性和摩擦系数进行分离，电泳技术根据带电颗粒的摩擦系数进行分离，离心技术是根据样品的质量、密度和摩擦系数进行分离的。从可处理样品的容量来看，层析和电泳只能用于小量样品的分析性或制备性分离。离心方法可以使用大容量转头，特别是离心沉淀和差速离心法可以一次处理数千毫升的样品液从分离样品的大小范围来看，由于层析和电泳技术一般是在凝胶中或支持介质中进行，所以它们能分离