微生物学：11结核分枝杆菌属

分枝杆菌属Mycobacterium

是一类细长略弯的杆菌，除二分裂繁殖外,尚有分枝生长的趋势，故名分枝杆菌。态生两靥之愁，娇袭一身之病。泪光点点，娇喘微微。闲静时如姣花照水，行动时如弱柳扶风。痨病

本属菌的共同特点：

无芽胞，无鞭毛，某些菌株有荚膜，有分枝生长趋势;细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸；为G+b,但不易着色，抗酸染色阳性，故又名抗酸杆菌（acid-fast-bacillus）；专性需氧，营养要求高，大多生长缓慢；不产生内外毒素及侵袭性酶类，其致病性与菌体成分以及机体对菌体成分所产生的免疫损伤有关；所致疾病呈慢性过程。分类

放线菌目→分枝杆菌科→分枝杆菌属：种类繁多，已发现80多个种。国际分类研究组（IWGMT）分为三类（表14-1）1.结核分枝杆菌群（缓慢生长菌）（1）人结核分枝杆菌：感染率高，占90%，对人致病，与牛结核分枝杆菌有交叉免疫。（2）牛结核分枝杆菌：感染率次之，对人致病。（3）非洲结核分枝杆菌：1968年从非洲肺结核病人的痰中分离出（4）田鼠分枝杆菌：对人一般不致病

2．非典型分枝杆菌（缓慢生长或快速生长菌）

除结核与麻风分枝杆菌以外的结核分枝杆菌（1）Ⅰ群（缓慢生长菌）：致机会肺部感染或游泳池肉芽肿（2）Ⅱ群（缓慢生长菌）：致儿童淋巴腺炎或成人肺部感染（3）Ⅲ群（缓慢生长菌）：致AIDS患者机会感染或肺部类结核感染（4）Ⅳ群（快速生长菌）：致局部和肺部类结核感染，软组织和手术后继发感染3．麻风分枝杆菌（不能培养菌）

目前尚不能在人工培养基上生长，致人类麻风病，为慢性传染病，主要侵犯深部组织和器官。目前对小鼠足垫接种成功，对犰狳易感,可作为研究的动物模型。微生物学诊断主要靠涂片，抗酸染色镜检，金胺O荧光染色镜检或病理活检。

分枝杆菌属其模式菌株为人结核分枝杆菌，标准菌株为ATCC27294。

结核分枝杆菌

M.tuberculosis

一．微生物特性形态染色细长略弯的杆菌,有时可见分枝状，可出现多形态:球形、串珠状或丝状。革兰染色阳性,但不易着色,抗酸染色阳性,经齐-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色,菌体呈红色,其他细菌和背景物质呈蓝色,用金胺O荧光染色→菌体呈金黄色荧光。本菌无鞭毛,无芽胞,有荚膜,但因制片破坏不易看到。培养特性

本菌为专性需氧菌,3%-5%的CO2可促进其生长。最适PH6.5-6.8,最适生长温度为370C。营养要求高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油、无机盐和孔雀绿等的罗-琴（Lowenstein-Jensen,L-J）固体培养基

才能生长良好，因蛋清含脂质生长因子，能刺激结核分枝杆菌生长，孔雀绿能抑制杂菌生长，故有利于本菌的分离培养与保存。该菌生长缓慢（18h/代）一般2-5周方长出菌落，菌落呈R型：表面粗糙、干燥、隆起、坚硬、呈颗粒状、结节状或花菜状，乳白色或淡黄色，不透明。在液体培养基中生长较为迅速，一般1-2周即可生长，呈菌膜生长，有毒力的菌株呈索状生长。若液体培养基中加入0.2%吐温-80（Tween-80）则可呈均匀生长。结核杆菌培养3.菌体成分—脂质、多糖和蛋白质1)脂质此菌含有大量脂质，占CW干重的60%,包括磷脂、脂肪酸和蜡质。其中蜡质所占比例最大,由分枝菌酸、索状因子、蜡质D组成.2)蛋白质本菌含有多种蛋白质,结核菌素(tuberculin)就是其中之一,与蜡质结合能使机体致敏,产生超敏反应,引起组织坏死和全身中毒症状,并与结核结节的形成相关．蛋白质也可刺激机体产生非保护性抗体.3）多糖TB含有各种多糖,其致病作用不清.

荚膜主要成分为多糖及部分脂质和蛋白质．它能与吞噬细胞表面的补体受体3(CR3)结合,有助于粘附与入侵;荚膜中的多种酶可降解宿主组织中的大分子物质,为本菌生长繁殖提供所需的营养物质;

荚膜能防止宿主的有害物质进入本菌;荚膜尚可抑制巨噬细胞中的吞噬体与溶酶体的融合,故与致病性密切相关．

生化反应

本菌生化反应不活泼,不发酵糖类．多数菌株触酶试验阳性,但热触酶试验阴性,而非典型分枝杆菌热触酶试验大多阳性．结核分枝杆菌烟酸试验及硝酸盐还原试验均呈阳性,而牛分枝杆菌均为阴性,有助于鉴别．

人结核分枝杆菌非典型分枝杆菌牛结核分枝杆菌触酶试验+热触酶试验-+烟酸试验+-硝酸盐还原试验+-变异性1）形态变异：

细长杆菌L型（Much颗粒）:

颗粒状或者丝状形,抗酸性下降或消失

2）菌落变异:

R型菌落(有毒菌株)S型(无毒菌株)

不良环境药物影响不良环境药物影响3）毒力变异:

有毒牛型结核分枝杆菌

减毒活疫苗(毒力大大下降,抗原性不变),1908年由BacilleCalmette-Guerin发现→BCG(卡介苗)4）耐药性变异:结核分枝杆菌耐药性变异（MDRTB）耐药菌株毒力明显减弱,但近年来多重耐药菌株逐渐增多,其TB病的死亡率高达７２％－８９％（USCDC），甚至引起爆发流行,给结核病的防治带来巨大困难.

药物选择(继发耐药)基因突变(原发耐药)13年230代L-J培养基抵抗力(三耐五敏)耐干燥:在干燥痰中可存活6-8个月,在含痰液的尘埃中可存活8-10天,故不能随便吐痰。耐酸碱:在3%HCI、6%H2SO4、4%NaOH中30min其活力不受影响,故常用此法来处理被杂菌污染的标本。耐某些染料及抗生素:对1:13000孔雀绿、1:7500结晶紫、青霉素等有一定抵抗力,故在培养基中可加入这些物质抑制标本中的杂菌生长,而不影响结核分枝杆菌生长,从而有利于初代分离培养。对75%的酒精敏感,常用于消毒病人口温表;对湿热敏感,湿热62-630C15min或者煮沸即被杀灭,故常用巴氏法消毒牛奶或用煮沸法消毒结核病人的餐具;对紫外线(日光)敏感:常用于消毒结核病房空气和病人衣物等;对某些化学消毒剂敏感,但需延长消毒时间:如5%石炭酸24小时,3%来苏尔1-2小时,方能杀灭痰内的结核杆菌;对抗痨药物敏感:异烟肼、链霉素、对氨基水杨酸(PAS)、利福平、乙胺丁醇、卡那霉素等,常用于结核病的治疗.抵抗力总结：四不怕◆对干燥的抵抗力特别强◆结核分枝杆菌对酸（3%HCl或6%H2SO4)或碱（4%NaOH)有抵抗力，15min不受影响◆对碱性染料有抵抗力◆对青霉素等抗生素耐药四怕◆对乙醇敏感——在70%乙醇中2min死亡◆对湿热敏感——62～630C15min杀死（巴氏消毒）◆对紫外线敏感◆对链霉素、异烟肼、利福平、环丝氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、对氨基水杨酸等抗痨药物敏感，但长期用药容易出现耐药性二.临床意义致病物质------CW上荚膜、蛋白质、脂质与致病性密切相关．所致疾病------结核病,以肺结核最为多见.传染源:开放性肺结核病人,病灶与外界相通,不断向体外排出结核分枝杆菌,经过尘埃或飞沫吸入肺泡,被巨噬细胞吞噬,在其中发育繁殖,导致病变产生.传染途径:主要通过呼吸道、消化道和受损的皮肤粘膜等途径→易感机体.部分结核分枝杆菌→血液→肺内、外播散→肺内外感染：肺结核、结核性脑膜炎、肾结核、骨结核、关节结核、生殖道结核等多种脏器组织的结核病(粟粒性结核),但有不少学者认为沿血液播散的结核分枝杆菌为该菌的L型.易感机体:未接种过卡介苗或机体免疫功能低下者.初次感染TB→原发性结核,多见于儿童,病灶多位于肺门部,且多为外源性感染,易形成原发综合症.再次感染TB→继发性结核,多见于成年人,病灶多位于肺尖部,既可内源性感染复发,也可为外源性新侵入的结核引起.

结核病至今仍为重要的传染病,据WHO估计,目前全球约1/3的人口感染过结核分枝杆菌,每年约有800万-1000万新发病例,每年至少有300万人死于结核病,相当于每天有8000人死于结核病,其中98%的病死率在发展中国家.20世纪80年代以来,随着AIDS发病率的增加,耐药性TB的不断增加,以及吸毒、免疫抑制剂的应用等原因,结核病的发病率出现了世界范围的回升。如果不加强结核病的防治,从2000-2020年,全球有10亿新结核感染者,其中约有2亿人发病,7000万人死亡.结核病已成为传染病中的头号杀手和最大死亡原因之一,被称为“白色瘟疫”,全球目前已处于结核病的紧急状态.

新中国成立后随着人民生活水平的提高,卫生状况的改善,特别是开展了群防群治,儿童普遍接种卡介苗,结核病的发病率和死亡率也大为降低,但近20年以来结核病的发病率又普遍增高,应引起我们高度的重视。免疫性—以CMI为主（

cell-mediatedimmunity）

结核的感染率高（80%-90%），但发病率低（4%±），多为隐性感染。说明人体对TB有相当强的免疫力。结核分枝杆菌是细胞内感染菌，主要以TL为主的细胞免疫。致敏TL+TB→淋巴因子：IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α…..共同作用杀死病灶中的结核分枝杆菌。结核的免疫属于传染性免疫（infectiveimmunity）,又称有菌免疫，即只有在体内存在结核分枝杆菌或菌体成分时，机体才对再次入侵的TB有免疫力，反之则无免疫力。机体对TB的传染、免疫和迟发型超敏反应同时存在，可测其一而知其二。常用结核菌素（tuberculin）皮肤试验来检测机体对TB是否有免疫力。

郭霍现象（Kochphenomenon）:有毒TB初次感染GP，10－14天后注射局部溃烂、坏死，附近LN肿大，细菌扩散漫延至全身，甚至死亡。有毒TB再次感染GP，1－2天内注射局部迅速溃烂，但很快愈合，且不扩散至附近LN和全身。说明机体对结核分枝杆菌所产生的CMI和超敏反应是同时存在的，是由不同的菌体成分激活不同的T细胞亚群释放出不同的细胞因子所引起的。现一般认为超敏反应是由结核菌素蛋白和腊质D共同引起的，而CMI是由结核分枝杆菌核糖体RNA(rRAN)引起。三.微生物学检验（一)检验程序图14-1(二)标本采集

根据感染部位不同分别采取痰液(晨痰)、支气管灌洗液、胸腹水、脑脊液(静置后，试管表面可有细薄凝块)、尿(晨尿或24小时尿取沉淀物10－15ml,诊断尿路结核需采集3－5份标本)、粪便（国外一般不做）、分泌物与组织等。

(三)检验方法

1.显微镜检查

直接涂片染色镜检：是一种常用的简易快速检查法。标本直接涂片(一接种环或0.01ml)或浓缩集菌(漂浮法、沉淀法)后厚涂片(3-4接种环，约0.1ml，面积1.5cm2)，经干燥固定后做齐-尼抗酸染色(热染法)或金胺’O’荧光染色。抗酸染色，用油镜观察，结核分枝杆菌呈红色。金胺’O’染色后用荧光显微镜HP镜观察，结核分枝杆菌呈金黄色荧光。每张涂片至少观察300个视野。

ThisisanacidfaststainofMycobacteriumtuberculosis(MTB).Notetheredrods--hencetheterminologyforMTBinhistologicsectionsorsmears:acidfastbacilli.组织中结核分枝杆菌(抗酸染色)结核分枝杆菌金胺’O’染色后用荧光显微镜HP镜观察Mycobacteriacanalsobestainedwithauramineandviewedwithfluorescencemicroscopy,inwhichacidfastbacillinowappearasglowingyellowrods.Thismethodiseasiertousetoscreenformycobacteriaandisthemethodroutinelyusedinsputumspecimenssenttothelaboratory.报告方式：“找到抗酸性杆菌”或“未找到抗酸性杆菌”。具体报告方式可用1984年国内统一暂定的厚涂片法填写报告单：表14-3染色方法

镜检结果

报告方式

抗酸染色(×1000)

未发现抗酸菌(至少１00个oil视野)－1-2个抗酸菌/300个oil视野±3-9个抗酸菌/100个oil视野+1－9个抗酸菌/10个oil视野++1－9个抗酸菌/1个oil视野+++≥10个抗酸菌/1个oil视野++++荧光染色(×450)

未发现抗酸菌(至少１00个视野)－1-2个抗酸菌/70个视野±2-18个抗酸菌/50个视野+4－36个抗酸菌/10个视野++4－36个抗酸菌/1个视野+++

＞36个抗酸菌/1个视野++++染色方法

镜检结果

报告方式

另直接涂片法也可用全视野发现1-4个GⅠGaffky报告法(GⅠ-GⅩ)

数视野发现1个GⅡoil视野

平均每视野内有1个GⅢ平均每视野内有2-3个GⅣ平均每视野内有4-6个GⅤ平均每视野内有7-12个GⅥ平均每视野内有13-25个GⅦ平均每视野内有26-50个GⅧ平均每视野内有100个GⅨ平均每视野内有100个以上GⅩ2.核酸检测

用PCR法(尤其是定量PCR法)或核酸探针可快速诊断结核分枝杆菌感染。其特异性与敏感性均>95%(可达100％)。3.色谱分析技术

因不同分枝杆菌的细胞壁中的分枝菌酸含量不同，故可利用气液相色谱(HPLC)分析不同分枝杆菌的脂肪酸，可进行菌种鉴定，具有快速、微量、敏感性高等特点。4.免疫学诊断

(1)抗PPDIgG检测：用PPD(纯蛋白衍生物)为抗原，用ELISA法检测结核病人血清中的抗PPDIgG，可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断，其敏感性为60％-80％，特异性约90％，肺结核病人的血清阳性率为80％-90%.(2)结核菌素试验(tuberculintest):

是利用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否产生迟发性变态反应的一种试验。结核菌素是结核分枝杆菌的菌体成分，可分为两种：一种是旧结核菌素(oldtuberculin,OT),另一种是纯蛋白衍生物(purifiedproteinderivative,PPD)包括：结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD两种，每0.1ml含5个单位，目前均用PPD.

原理：结核分枝杆菌的感染、免疫、变态反应三者同时存在，所以可用PPD来做皮肤试验，看局部皮肤有无变态反应，从而推测机体是否有传染和免疫。

方法与结果判断：取0.1mlPPD(含5u)前臂皮内注射，48－72小时后.局部红肿硬结>5mm者为阳性。表明机体可能感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗，但不一定患结核病；局部红肿硬结>15mm为强阳性，表明机体可能有活动性结核，应进一步检查；局部红肿硬结<5mm为阴性，表明未感染过结核分枝杆菌，但应排除原发性结核病的早期、老年人、严重结核病(如粟粒性TB、结脑)或有其它严重疾病(如麻疹、淋巴瘤、白血病、AIDS)以及免疫抑制剂应用者。

用途：①可作流行病学调查,了解人群对结核分枝杆菌的感染率。②选择BCG接种的对象及接种的效果。③可作为婴幼儿(<3岁)结核病诊断的参考指标。④可测定肿瘤病人的细胞免疫功能。结核菌素试验阳性(3)全血干扰素测定法：

当全血＋PPD/植物血凝素共同孵育后，致敏LC可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。本试验的结果与结核菌素试验相当，且受BCG接种史影响小，又能与非结核分枝杆菌进行区分，同时尚可避免结核菌素试验在操作上与结果判断上存在的多种主观或人为因素的影响。

5.分离培养(1)标本前处理：结核病人的痰或其它标本大多含有杂菌，在培养前可用4％NaOH、4％H2SO4、胰酶-新洁尔灭法等对标本进行处理，以达到杀灭杂菌或减少杂菌和液化痰标本的目的。