实验一植物染色体压片法

实验一植物染色体压片法第一页，共三十四页，2022年，8月28日一、实验目的学习植物根尖染色体压片方法的基本技术。熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化特点，为研究染色体组型等打基础。第二页，共三十四页，2022年，8月28日二、实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。洋葱体细胞中有8对共16条染色体，在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。第三页，共三十四页，2022年，8月28日三、实验用品（一）材料大蒜（Aillumsativum）、洋葱（Aillumcepa、2n=16）根尖或蚕豆（Viciafaba、2n=12）根尖（二）器材显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、刀片、试剂瓶、指管（或小培养皿）、冰箱、培养箱、吸水纸。（三）试剂70%乙醇、45%冰醋酸、对二氯苯饱和水溶液、0.2%秋水仙素溶液、卡诺氏固定液（甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份）、改良苯酚品红染色液、盐酸酒精离析液（浓盐酸：95%乙醇=1：1）、叔丁醇、二甲苯、95%乙醇、尤派胶或中性树胶。第四页，共三十四页，2022年，8月28日四、实验方法和说明（一）生根用刀片将洋葱的老根削去露出鳞基，然后将鳞基置于盛水的小烧杯上，放在25℃培养箱内培养。待根长到2cm左右时，在上午九时切下根尖进行下一步处理。植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影咱分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下生根，掌握有丝分裂高峰期，以使得到更多的处于有丝分裂中期的细胞。第五页，共三十四页，2022年，8月28日第六页，共三十四页，2022年，8月28日（二）预处理

把根尖放到对二氯苯饱和水溶液，或0.02％秋水仙素溶液中，浸泡处理3—4小时。预处理是为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，一般在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。通常是在分裂高峰前，把根尖浸泡到药剂中处理3～4小时以上。第七页，共三十四页，2022年，8月28日①低温预处理：低温处理可以引起染色体的缩短并可获得较多的中期分裂相，而且此法无须使用任何药物，安全性高。但不同的植物所需的预处理温度是有差异的，如小麦的处理温度为1～5℃，水稻和玉米则需6～8℃，剪下的根尖置于盛有蒸馏水的烧杯内，放入冰箱中低温预处理20～40h。第八页，共三十四页，2022年，8月28日②秋水仙素（colchicine）：是从百合科植物秋水仙的种子和鳞茎中提取的一种生物碱。它的分子式为C22H25NO6。纯的秋水仙素为针状结晶，一般商品秋水仙素为淡黄色粉末。熔点为155℃，味苦。易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，但在热水中溶解度较低，不易溶于苯和乙醚。秋水仙素毒性极强，可以导致眼睛暂时失明和使中枢神经系统麻痹而导致呼吸困难。在使用过程中要特别注意安全，同时要做好药品的管理工作。一般认为秋水仙素对纺缍丝有麻痹和毒害作用，也有人认为秋水仙素通过抑制ATP的机制从而破坏纺缍丝的形成及活动。处理后的染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。秋水仙素水溶液的作用效果与其浓度成正比，浓度越高，作用效果越强。通常用0.05%～0.2%的秋水仙溶液处理2～4h。第九页，共三十四页，2022年，8月28日③饱和对二氯苯（p-Dichlorobenzene）：其分子式为C6H4Cl2，无色结晶，具有特殊的臭味，常温下可升华。易溶于乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，难溶于水，易燃而且有毒。由于对二氯苯难溶于水，所以一般用它的饱和水溶液，它的作用效果与秋水仙素相似，但价格却低得多，便于广泛使用。室温下处理3～5h，此法特别适于染色体小而多的植物，计数染色体制片效果最好。第十页，共三十四页，2022年，8月28日④8-羟基喹啉（8-Hydroxyquinolin）：其分子式为C9H7NO，为白色结晶或粉末，溶于酒精而难溶于水。8-羟基喹啉的作用机制，一般认为它首先引起细胞质粘度的改变，结果导致纺缍体的活动受阻。所用浓度范围是0.002～0.004M之间，特别适用于具有较大染色体的植物。它的优点是经它处理后，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。下表为不同材料采用不同预处理方法获得的效果，供参考。第十一页，共三十四页，2022年，8月28日植物名称染色体数(2n）

处理因素

处理时间

温度

效果*

小麦

42

0.2%秋水仙素水溶液

9:00-11:00

25℃

+++

小麦

42

对二氯苯饱和水溶液

10:00-14:00

室温

+++

小麦

42

1～4℃冰箱

20-24小时

1～4℃

+++

小黑麦

56

对二氯苯饱和水溶液

10:00-14:00

室温

+++

豌豆

14

对二氯苯饱和水溶液

10:00-11:30

室温

+++

烟草

48

对二氯苯饱和水溶液

8:30-11:30

室温

+++

蚕豆

12

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

20:00-23:00

室温

+++

蚕豆

12

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

14:30-17:30

8℃

+++

洋葱

16

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

7:30-11:30

15℃

+++

茄子

24

0.002M8-羟基喹啉

9:00-13:00

15℃

+++

大麦

14

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

8:00-11:00

25℃

++*+++优++良。第十二页，共三十四页，2022年，8月28日（三）固定

固定时，将根尖投入固定液中室温处理3～24小时。材料若不及时用，可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次，再换入新的70%酒精中，置于冰箱内0～4℃保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。通常采用的固定液是卡诺氏固定液。固定的目的是借助于物理的或化学药剂的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死；并使其结构和内含物，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于着色，可以较清楚的显现细胞在生活是不易看清的结构。第十三页，共三十四页，2022年，8月28日第十四页，共三十四页，2022年，8月28日（四）解离

将固定后（或保存后）的根尖分装到指管内，用清水洗几次，吸干水，加入盐酸酒精离析液，在室温下水解10～20分钟，解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。解离后的根尖用水轻洗2～3次，以利于着色。解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。第十五页，共三十四页，2022年，8月28日第十六页，共三十四页，2022年，8月28日第十七页，共三十四页，2022年，8月28日（五）水洗经解离的材料用蒸馏水反复冲洗4-5次。目的是冲去材料中的酸以利于染色。第十八页，共三十四页，2022年，8月28日（六）染色

将解离后的根尖放在洁净的载玻片上，切取其根尖分生组织（约1mm左右），剁成碎末，滴加改良苯酚品红染色液染色10-15分钟左右。改良苯酚品红染液：是近年来观察植物染色体时新使用的比较理想的染色剂，优点较多，使用方便。配法顺序如下：原液A：取3克碱性品红溶于100毫升70%酒精中，此液可以长期保存。原液B：取A液10毫升加入90毫升5%苯酚(即石炭酸)水溶液中(2周内使用)。原液C：取B液55毫升加入6毫升的冰醋酸和6毫升38%的甲醛(可长期保存)。染色液：取C液10-20毫升，加入90-80毫升45%醋酸和1.5克山梨醇。放置2周后使用，染色效果显著，可普遍用于植物组织的压片法和涂片法，使用2-3年不变质。山梨醇为助渗剂，兼有稳定染色液的作用。如果没有山梨醇，也能染色，但效果稍差。改良苯酚品红染色液对果蝇唾液腺染色体的染色效果与醋酸染洋红染色液的染色效果是相同的。而且用改良苯酚品红染色液还能提高工效，简易节约的优点。第十九页，共三十四页，2022年，8月28日第二十页，共三十四页，2022年，8月28日第二十一页，共三十四页，2022年，8月28日第二十二页，共三十四页，2022年，8月28日（九）永久装片把压好的玻片标本，放在冰箱冷藏箱里冻结。然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。第二十三页，共三十四页，2022年，8月28日五、作业1．绘有丝分裂中期或后期细胞图像。2．在你观察的细胞分裂过程中，哪些分裂时期最多？3．根据你的实验情况总结出制备好一张优良的细胞分裂标本应注意哪些问题?第二十四页，共三十四页，2022年，8月28日第二十五页，共三十四页，2022年，8月28日第二十