基因组编辑技术及其应用

基因组编辑(genomeediting)技术及其应用基因组编辑(genomeediting)技术是针对目标基因组，通过插入、缺失或替换的手段对基因组中的靶基因进行定点改造：1、突变基因代替正常基因——基因功能的研究。2、正常基因代替突变基因——基因治疗。

应用前景广阔基因编辑技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。传统的基因组编辑技术主要包括：Cre-LoxP（细菌噬菌体）重组酶技术：Flp-Frt（酵母）重组酶技术：是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。该类技术虽然重组效率高，但实验周期长，因此其应用具有很大的局限性。Cre-LoxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre-LoxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。RNA干扰

(RNAinterference，RNAi)RNAi技术的出现曾给基因治疗的应用带来了很大的希望，但经研究发现，RNAi对靶基因的失活不完全，存在脱靶效应，对细胞有一定的毒害作用，因此暂无法应用于临床治疗之中。人工内切核酸酶(engineeredendonuclease，EEN)技术人工内切核酸酶技术的优势在于其摆脱了传统基因组操作技术对于胚胎干细胞的依赖，并且能够应用于更多的物种，使基因组编辑技术的应用进入一个新的阶段，因此有很大的潜力能够在临床上应用。人工内切核酸酶技术两个关键步骤：1、利用构建好的人工内切核酸酶与靶DNA片段相结合并且特异性地切割基因组DNA，形成双链断裂结构(double—strandbreak，DSB)。2、利用目的细胞内的非同源末端连接(non—homologousandjoining，NHEJ)或同源重组(homologousrecombination，HR)系统来对形成双链断裂结构进行修复，从而实现对目标基因组编辑。人工内切核酸酶技术主要包括3种：1、锌指核酸酶(Zinc．fingernucleases，ZFNs)技术2、转录激活因子样效应蛋白核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)技术3、CRISPR／Cas(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPRassociated)技术ZFNs技术ZFNs技术是最早发现的人工内切核酸酶介导基因组编辑技术，与传统的方法相比其优点是定点整合效率高，但由于其构建难度大、费用高的缺点，使其应用受到很大的限制。ZFNs技术1985年，Miller等首次在非洲爪蟾(Xenopulaevis)的转录因子(transcriptionfactorIIIA，TFIIIA)中发现了具有锌指结构的蛋白(Zinc—fingerprotein，ZFP)。锌指结构是由多个Cys~His残基通过Zn2+螯合而成的蛋白质结构，根据其含有保守结构域的不同，可以分为C2H2、C4和C6三种类型。锌指结构的特点在于能够与相应的DNA序列发生特异性的结合，ZFNs技术就是利用锌指结构的这一特点，通过人工合成的方法，将锌指DNA结合域(Zinc—fingerDNA—bindingdomain)与相应限制性内切酶的DNA切割域(DNAcleavagedomain)融合在一起，使其能够识别特定的结合位点并对靶DNA进行切割。典型的ZFNs一般包含有3-6个独立的锌指结构，每个锌指结构能够识别3bp长度的碱基，因此，一个ZFNs能够识别9—18bp长度的碱基。最常用的ZFNs一般包含有3个锌指结构，以DNA链上3'-5'的顺序分别命名为F1(Finger1)、F2(Finger2)和F3(Finger3)，而锌指DNA结合域与DNA切割域则通过连接区(Linker)相结合。ZFNs技术中使用得最多的限制性内切酶为Fokl，该酶是一种IIS型限制性内切酶，其能够特异性地识别DNA分子上的靶位点(CCGG)并在下游对其进行切割。当2个ZFNs分子同时与DNA结合时，其能在2个结合位点的间隔区发生切割作用，从而形成DNA双链断裂区。双链DNA断裂后，受体细胞会启动两种不同的DNA损伤修复机制：1、在没有外源同源序列的情况下，细胞启动NHEJ修复机制将断开的DNA末端重新连接起来；2、在存在外源同源序列的情况下，细胞就可以启动HR修复机制。利用这些机制，可以实现基因敲进和基因修复，同时如果外源的同源序列是不完整的，便可以达到基因组编辑的效果。TALENs技术TALENs技术与ZFNs技术相比其优点在于构建更为简单，细胞毒性较低，但构建成本仍然偏高，并且有其应用的局限性。TALENs技术是近年发展起来一种对基因组进行定点编辑的新技术，由于其具有高效的特点，20l2年Science选为年度十大科学突破。TALENs核酸酶由两个部分组成：1、TALE蛋白2、核酸内切酶TALE蛋白家族是一类来源于植物病原菌黄单胞杆菌(Xanthomonas)的分泌蛋白，1989年，Bonas等第一次发现了该蛋白家族的成员AvrBs3。TALE蛋白与转录因子的结构相类似它可以通过调控宿主植物中相关内源基因的表达量，从而使病原菌更容易侵染植物。TALE蛋白是由N端序列(N-terminalsequence，NTS)、中心重复区和C端序列(C—terminalsequence，CTS)这3部分组成，其中蛋白质的N端一般含有转运信号(translocationsignal)，C端含有转录激活结构域(activationdomain，AD)和核定位信号(nuclearlocalizationsignal，NLS)，其中核定位信号主要为一个异位结构域。TALE蛋白结构图中心重复区由12～30个重复单元组成，每个单元含有34个氨基酸残基，该单元除了12和13位重复可变双氨基酸残基(repeatvariantdiresidues，RVD)序列外，其他序列完全相同。RVD序列决定了TALE蛋白的识别碱基的特异性。不同的RVD能够分别对应识别A、T、G、C碱基中的一种或多种。在应用过程中最常见的4种RVD分别为HD(His-Asp)、NG(Asn-Gly)、NI(Asn-Ile)、NN(Asn-Asn)。HD识别C，NG识别T，NI识别A，NN识别G或A。CTS序列含有核定位信号及转录激活因子，其功能是帮助TALE蛋白从细胞质进入细胞核并发挥转录激活作用。核酸内切酶Fok1只有形成二聚体时才具有酶切活性。与ZFNs技术相似，当Fok1二聚体对DNA双链进行切割时，会引发NHEJ或HR修复机制，利用该机制可以达到基因组编辑的效果。CRISPR／Cas技术CRISPR／Cas：成簇规则间隔短回文重复序列与Cas蛋白(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR／Cas）CRISPR／Cas技术作为一种构建简单、成本低的人工内切核酸酶技术，因其具有较高切割效率并在多种生物中都有广泛的应用前景，被Science杂志评为2013年十大科学突破之一。CRISPR／Cas技术在自然环境中由于噬菌体的存在，细菌在长期的选择压力下进化出了CRISPR／Cas免疫防御机制，CRISPR／Cas系统是由RNA介导的，可遗传的有效的获得性免疫机制，存在于约40％的细菌和90％的古细菌中，该系统主要是细菌为抵抗噬菌体或质粒所带来外源DNA片段入侵的免疫系统。CRISPR重复序列家族的结构通常由一个前导区(Leader、重复序列区(Repeat)和间隔区(Spacer)所组成，Leader区是一段长约300～500bp左右富含AT碱基的DNA序列，其位于CRISPR基因簇上游，该区段序列在同一物种内相对保守，但在不同物种之间差距很大。Repeat区是一段长约24-48bp的序列相对保守的回文序列-同向重复序列(directrepeat，DR)，该序列打开后能形成发夹状结构。Repeat区序列并不连续，中间被长度约为26～72bp的Spacer区所分隔。

Spacer区序列与一些噬菌体和质粒的序列存在一定程度的同源性，使该系统能够特异性地识别一些噬菌体和质粒从而抵抗外源基因的侵染。当噬菌体入侵细菌的起始阶段，Cas蛋白复合物与噬菌体中相应的原型间隔序列(proto-spacer)相结合并裂解相关序列，裂解后的proto-spacer序列整合到CRISPR位点的重复序列之间，随即被转录成为crRNA(CRISPRRNA)，并且crRNA的两侧还保留有部分Repeat序列.当宿主再次被噬菌体侵染时，crRNA能够靶向噬菌体的proto-spacer序列并将其降解，而Cas是与CRISPR序列相关的(CRISPR-associated)核酸内切酶(如Cas9)，这个CRISPR/Cas能和一段与靶DNA片段匹配的20个核苷酸长度的单导向RNA(single-guideRNA，sgRNA)一道，构成RNA引导性核酸酶(CRISPR-CasRNA-guidednucleases，CRISPR/CasRGNs)免疫系统。同一个物种CRISPR位点的DR区域绝大多数非常保守，部分间区序列与噬菌体、大质粒等外源基因组具有高度同源性，这些同源部分被称作原型间区序列(proto-spacer)。sgRNA由crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)两种非编码RNA通过碱基配对结合而成。Cas9与sgRNA协同作用，在原型间区序列邻近基序(proto-spaceradjacentmotif，PAM)限定的位点上剪切双链DNA(PAM区的序列要求为NGG，即Cas9靶点的通式为(5’-GN19NGG-3’)。由于Cas9含有1个RuvC-like核酸酶功能域和1个McrA-likeHNH核酸酶功能域，因此在识别的靶位点处，McrA-likeHNH核酸酶结构域剪切互补链，而RuvC-like结构域剪切非互补链。CRISPR／Cas系统分型I型CRISPR／Cas系统：使用Cas3蛋白II型CRISPR／Cas系统：使用Cas9蛋白III型CRISPR／Cas系统：使用Cas6蛋白CRISPR／Cas9系统CRISPR／Cas系统在基因组编辑方面具有优势，就II型系统来说仅需要一段20bp的DNA序列和Cas9蛋白。目前，已有商品化的质粒供研究者选择，仅需将20bp的sgRNA克隆到CRISPR／Cas9质粒即可。基因编辑新技术的异同点比较ZFN与TALEN共同点：(1)两者都是人工改造的核酸内切酶:有1个DNA识别域特异性地识别靶位点，有1个核酸内切酶特异性剪切DNA双链，两者配合着行使功能。(2)同时使用FokⅠ家族的核酸内切酶:FokⅠ是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只有形成二聚体时才能发挥酶切活性。(3)切割后的DNA修复机制相同:在2个靶位点之间剪切DNA，在DSB处诱发DNA的NHEJ或HR损伤修复机制。ZFN与TALEN不同点：(1)开发时间:相对于2007年才起步的TALEN技术，ZFN技术的研发和商业化已相当成熟。(2)目标序列的识别:锌指结构域识别的是三联碱基，而TALEN结构域识别的是单一的核苷酸。如果一个蛋白质包括3个锌指结构的话，它可以识别9个碱基对的片段，而TALEN则需要9个重复单元的可变双氨基酸残基位点。但TALE的核酸识别单元与任一碱基(A、G、C、T)有恒定的对应关系，构建时不受基因序列、细胞、物种等的限制，并且设计简单、实验周期短、成本低，具有与ZFN相等或更好的活性。(3)上下文依赖效应:ZFN在识别DNA位点时，存在着上下文依赖效应。即识别DNA的重复氨基酸之间会产生相互作用，使得识别特异性发生改变，从而影响基因打靶的效果。但目前尚未见TALEN具有上下文依赖效应的报道。(4)脱靶效应:锌指酶切割时会产生脱靶效应，从而产生毒副作用。TALEN的脱靶情况少，毒性低。(5)靶向基因序列的长度:TALEN可以靶向较长的基因序列，而ZFN的靶向基因序列较短。CRISPR-Cas与ZFN和TALENCRISPR-Cas系统通过对目标序列的识别及核酸酶的剪切来造成靶位点的双链断裂。因此理论上，只要将DNA功能识别域和核酸内切酶换成sgRNA和Cas9，就能对任意基因组进行编辑。但CRISPR-CasRGNs相对于ZFNs和TALENs来说，具有优势:CRISPR-Cas优势

(1)ZFN和TALEN需要针对不同靶点合成和组装不同的识别序列，耗时耗力且成本高，而CRISPR-Cas系统只需要改变一段短的RNA序列即可识别不同的位点，更加方便经济。构建动物模型时，ZFN和TALEN需要每次都转录为mRNA，而CRISPR-Cas系统只需要一次Cas核酸酶转录就可完成多次试验，难度大为降低。(2)CRISPR-Cas系统可同时剪切靶基因上多个位点，而ZFN和TALEN只能单次单个。(3)crRNA和tracrRNA还可以重新装配成sgRNA，其包含的序列足以编程Cas9，介导靶DNA双链断裂及随后的修复或者靶向性基因置换。Cas9/sgRNA的主要缺点5'-GN19NGG-3'的结构有时会出现限制性，会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变，脱靶位点的突变率有可能和靶位点一样甚至更高。在脱靶率降下来或精确度提上去之前，这种混杂效应可能使得现有的RGN平台还无法鉴别人类细胞中任何给定RGN的所有潜在脱靶位点，因而现在还不适合治疗应用。人们正在寻求利用计算机模型计算出最佳编辑位点，或者增加sgRNA的数量与长度，或者优化RNA片段让其包含稳定的发卡结构，总之就是力求在高目标效应和低脱靶效应间找到一个最优平衡点。同源重组：腺相关病毒(AAV)腺相关病毒(AAV)是一个常见的人细小病毒，自然缺陷、无包被和无致病原性。AAV复制周期由两个明显的阶段构成：潜伏期和增殖期。在缺少辅助病毒诸如腺病毒(Berns,1990;Muzyczka,1992;Berns和Giraud,1996)、疱疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒条件下(Yakobson等,1989),AAV能复制产生子代病毒颗粒。在缺少辅助病毒的情况下，腺相关病毒整合其基因组到19号染色体的一个特别位点并保持整合直到随后的辅助病毒将其从潜伏状态下拯救出来(Kotin等，1990)。AAV的位点特异性的整合能力、其自然缺陷以及其无致病原性使其成为基因治疗载体成为可能。慢病毒CAS9细胞基因敲除全套解决方案人工改造过的CRISPR/CAS9系统通过gRNA（shortguideRNA）引导Cas9蛋白识别并剪切带有gRNA靶点的双链DNA，用于基因敲除和精确编辑DNA等操作。要在难转染的细胞上做基因编辑等操作，需要CRISPR/CAS9技术配合一个高效率的转基因方式——慢病毒CAS9系统。全套解决方案一、gRNA靶点的选择CAS9/gRNA剪切活性与gRNA靶点的识别序列有关，每个gRNA靶点的剪切活性都会不同，但存在大概1/4的靶点本身没有切割活性。为了避免因为靶点自身没有切割活性而导致基因编辑失败，白白浪费转基因成本和漫长等待的时间，必须先对设计好的gRNA靶点做切割活性验证。对于难转染的细胞和不方便做内源活性验证的情况可以用CAS9体外酶切法检测gRNA靶点切割效率。此方法不需要构建打靶质粒就可以针对设计好的靶点，用CAS9酶在EP管里酶切带有靶点的DNA片段后跑电泳显示，而且仅需两天的操作。体外Cas9酶切DNA效果与DNA浓度、Cas9酶量、反应时间、gRNA的量、靶点活性有关，为了科学地评价gRNA靶点效率，将固定DNA浓度和Cas9酶量，在一定单位时间内，测量Cas9酶切靶点DNA的效率，并通过与已知有活性的gRNA靶点进行比较，评价目标gRNA靶点的活性。选择切割效率高的gRNA靶点包装慢病毒，既降低了多余无效靶点的包装成本，又减轻了后续病毒侵染及突变体克隆筛选的工作量。二、慢病毒载体的选择三、慢病毒包装慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究。在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，提供基因编辑功能。多个靶点（2-3个为宜）的慢病毒CAS9毒液侵染目的细胞后，通过流式或者药物筛选出侵染成功的混合克隆细胞，取大概1/10的混合克隆细胞提取基因组DNA，使用T7E1非配对内切酶法进行内源活性检测，对T7E1酶切阳性的PCR产物连T载体测序进一步确定。五、单克隆筛选选择T7E1酶切阳性率高且经过测序确认的混合克隆细胞铺单克隆，等长满后一个个使用T7E1非配对内切酶法初筛，再结合T载体克隆测序进一步鉴定，并跟野生型对比，确定具体突变。基因敲除

基因敲除是将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。常用同源重组的方法。敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。基因敲除-发明者此技术是由马里奥·卡佩奇、马丁·埃文斯与奥利弗·史密斯所开发，最初是以基因敲除小鼠（knockout

mouse，昵称：KO

mouse）完成实验，三人并因此获得2007诺贝尔医学奖。基因敲除-常用技术一、利用同源重组进行基因敲除二、利用随机插入突变进行基因敲除三、RNA干扰引起的基因敲除四、单克隆抗体—抑制与其相对应的蛋白功能五、小分子化合物—能与基因或蛋白相互作用一、利用同源重组进行基因敲除利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。二、利用随机插入突变进行基因敲除大规模的随机插入突变，它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变。

三、RNA干扰引起的基因敲除RNA干扰（RNA

interference,RNi）是一种普遍的转录后基因沉默的机制，由siRNA（small

intereferenceRNA）引起，siRNA是外源基因产生的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21-22nt的一系列片段的总称，具有很强的关闭基因的功能，能够介导RNA干涉现象，诱导出一种由siRNA核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物（RNA-induced

silencingcomp

lex,RISC）。RISC能够解开siRNA并精确的指导特异mRNA降解。通过将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。基因敲除-基本步骤利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：1、获得ES细胞2、构建基因载体3、将基因打靶载体导入同源的胚胎干细胞（EScell）中4、用选择性培养基筛选打靶成功细胞5、观察基因变化小鼠的生物学形状的改变1、获得ES细胞现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。

2、构建基因载体把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如neo基因，TK基因等）的载体上，此重组载体即为打靶载体。3、将基因打靶载体导入同源的胚胎干细胞（EScell）中将基因打靶载体通过一定的方式（常用电穿孔法）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。4、用选择性培养基筛选打靶成功细胞

一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。

5、观察基因变化小鼠的生物学形状的改变通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

缺陷随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，

敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。基因敲除-应用1、

建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料

2、

改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学

3、

治疗遗传病，这包括去除多余基因或修饰改造原有异常基因以达到治疗的目的。

4、

改造生物、培育新的生物品种。

基因打靶技术的新进展

ａ．条件性打靶

条件性基因打靶(conditionalgenetargeting)可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。利用Cre／LoxP和来自酵母的FLP—frt系统可以研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的loxP，并以此两侧装接上loxP的(“loxPfloxed”)ES细胞产生“loxPfloxed”小鼠,然后，通过将“loxPfloxed”小鼠与Cre转基因鼠杂交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre重组酶)，产生靶基因发生特定方式(如特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。在“loxP

floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP，但靶基因并没有发生其他的变化，故“loxPfloxed”小鼠表型仍同野生型的一样。

但当它与Cre转基因小鼠杂交时，产生的子代中将同时带有“loxP

floxed”靶基因和Cre基因。Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。这样，靶基因的修饰(切除)是以Cre的表达为前提的。Cre的表达特性决定了靶基因的修饰(切除)持性：即Cre在哪一种组织细胞中表达，靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞；而Cre的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。所以只要控制Cre的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。ｂ．诱导性打靶

诱导性基因打靶就是以Cre/loxp系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。

人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性打靶类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。其优点有：1、诱导基因突变的时间可人为控制；2、可避免因基因突变而致死胎的问题;3、在2个loxP位点之间的重组率较高；4、如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。如果在Cre—ERT和Ad—Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达，其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。c.基因捕获技术典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因，neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来，从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。这些克隆可以在96孔培养板中生长、复制并用于基因型分析，大规模地保存和分析中靶ES细胞在小型的实验室中也是可行的。此方法的缺点是只能剔除在Es细胞中表达的基因．单种的细胞类型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕获载体从理论上来讲应能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在ES细胞中进行基因捕获还是大有可为的。

在体细胞中应用基因捕获可以剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体、这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰，基因编辑新技术的应用基因功能研究基因敲除是在活体动物上验证基因功能必不可少的逻辑环节，但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体动物模型选育等一系列步骤，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术敲除大鼠或小鼠身上的某个基因一般也需要1年以上。基因编辑新技术则不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。ZFN技术已在大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、玉米、烟草等模式生物或经济物种的细胞或胚胎中以及包括诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)在内的人体外培养细胞系中成功地实现了内源基因的定点突变，其中在果蝇、斑马鱼、大鼠等物种中还获得了可以稳定遗传的突变体。2009年，威斯康辛医学院、SangamoBiosciences、Sigma-Aldrich等多家机构使用ZFN技术，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且带有该突变的大鼠所生育的后代同样带有该基因突变。GEURTSAM，COSTGJ，FREYVEＲTY，etal．Knockoutratsviaembryomicroinjectionofzinc-fingernucleases［J］．Science，2009，325(5939):433．CUIX，JID，FISHEＲDA，etal．Targetedintegrationinratandmouseembryoswithzinc-fingernucleases［J］．NatBiotechnol，2010，29(1):64－67．MENGX，NOYESMB，ZHULJ，etal．Targetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzinc-fingernucleases［J］．NatBiotechnol，2008，26(6):695－701．BEUMEＲKJ，TＲAUTMANJK，BOZASA，etal．EfficientgenetargetinginDrosophilabydirectembryoinjectionwithzinc-fingernucleases［J］．PNAS，2008，105(50):19821－19826ZHANGF，MAEDEＲML，UNGEＲ-WALLACEE，etal．HighfrequencytargetedmutagenesisinArabidopsisthalianausingzincfingernucleases［J］．PNAS，2010，107(26):12028－12033．TwosmallheartswereformedinaCas9/gRNA-inducedmutant(right),whichphenocopiedthatinthefautm236ageneticmutant,GenomeeditinginhumancellsusinganengineeredtypeIICRISPRsystem基因治疗传统的基因治疗是将正常的基因片段引入细胞中替代有缺陷的基因，但这种方法难以精准控制，可能产生很大的毒副作用。基因编辑新技术可以精确定位，在靶位点进行修正或进行基因切除，达到基因治疗的目的。Lietal利用ZFN技术能在染色体上精确定位的优势，通过“剪切”和“粘贴”基因，在实验小鼠体内实现了血友病治疗，避免了传统基因疗法带来的插入诱变风险，首次取得了基因组编辑在基因疗法上的突破。Yusaetal利用ZFN技术矫正了iPSC中的1个胰岛素缺陷突变基因。Bacmanetal利用FokⅠ核酸结构域开发出了一种切口酶(nickase)，修饰后的切口酶只引起单链断裂，不想要的切口可通过细胞的单链断裂修复机制得到修复。虽然这种切口酶在靶位点上的效率低于核酸酶，但由于其不会产生脱靶效应，对受到脱靶效应限制的基因治疗将更加实用。Bacmanetal利用TALEN技术清除了来自于病人线粒体内的有病DNA。这是TALEN首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗母系遗传的线粒体病。在