非编码RNA研究方法及应用之长链非编码RNA

非编码RNA研究方法及应用长链非编码RNA

长度在200nt以上、不编码蛋白、但参与细胞内多种生物学过程的RNA分子.人类基因组计划研究发现只有3%的基因组序列是编码蛋白质的基因，而占人基因组62%的序列转录为lncRNA，这一结论提示非编码区域可能通过表达lncRNA，活跃地参与到生物学功能的调控中.截至目前，在NONCODE中已经收录了73370个lncRNA，它们分别来自1239个物种，仅有不到200个进行了功能注释，人类对lncRNA的研究还知之甚少.随着对lncRNA在哺乳动物进化及人类疾病发生发展中作用的日益关注，lncRNA调控机制已成为当前生命科学研究的新热点.1)在编码蛋白基因的上游启动子区(橘色)转录，从而干扰邻近蛋白编码基因(蓝色)的表达(如酵母SER3基因);2)抑制RNA聚合酶Ⅱ,或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因(蓝色)表达；3)lncRNA(紫色)与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，进而产生不同的剪切形式；4)lncRNA(紫色)与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA,调控基因的表达水平；5)lncRNA(绿色)结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；6)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；7)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；8)可作为小分子RNA(如miRNA)的前体分子。Signalarchetype（信号原型）：作为转录活性的分子信号或指示剂。Decoyarchetype（诱饵原型）：与其他调控RNA或蛋白结合并隔离。Guidearchetype（指导原型）：指导核糖核蛋白复合物定位到特定目标。Scaffoldarchetype（支架原型）：作为相关分子元件（蛋白和/或RNA）组装的平台。

LncRNA的分类lncRNA命名指导标准

每一条lncRNA的名字应具有唯一性

.lncRNA的名字应是描述基因的缩写.lncRNA名字仅由拉丁字母和阿拉伯数字组成

.lncRNA的名字中不应涉及具体的物种类型

.lncRNA的标识应避免采用一些常用的词汇.lncRNA的标识应尽可能的反映其功能

.功能性转录假基因应包含它们假基因的名字.首先，每条lncRNA的名字应具有唯一性，不能发生一个基因几个名字或存在重名的现象。因而，作者在发表新lncRNA时，可先获取HGNC的认可，如果作者发布的名字已在其他地方使用过，HGNC将会指定一个新名字供作者选择。lncRNA的名字应是描述基因的缩写，便于人们理解名字的含义。如BANCR就是BRAF-activatednon-proteincodingRNA的缩写。lncRNA的名字应仅由拉丁字母和阿拉伯数字组成，不应出现标点符号。连字符仅在特殊场合使用，如：反义编码蛋白基因可在标识中加连字符（BACE1-AS就是BACE1antisenseRNA的名字）。lncRNA的名字中的字母应为大写，为了与其它种类物种的基因区别开来（如啮齿动物基因的标识只要求首字母大写，其余小写），人类基因标识中的字母都应为大写，例如HOTAIR基因，在人类中叫HOTAIR，而在老鼠中写成Hotair。lncRNA的名字中不应涉及具体的物种类型，例如：如果基因名字中有H/h（代表人类），由于牵涉到同源基因的问题，就会造成一些疑惑和误导。lncRNA的命名应避免采用一些常用的词汇，否则会给分析研究带来很多问题，比如：“AIRN”基因最初公布时叫“AIR”，从公共数据库中搜索可得到22万条不相关的信息，而搜索“AIRN”则只有10条信息。lncRNA的命名应尽可能的反映其功能，如XIST基因是“X(inactive)-specifictranscript”的缩写，该基因的作用是参与沉默一对X染色体的转录。命名的时候尽量反映基因通常的功能，而不体现其突变表型。其命名应简洁明了，不应包含以下信息：*具有攻击或轻蔑的色彩。*具有个人及地方色彩。*含有神化，虚构或历史人物的名字。*含有“臆想”和没什么意义的信息。功能性转录假基因在命名时应保留它们假基因名称且不应改变其基于功能的名称。为了方便搜索，这个功能应加在名字的最后。eg:PTENP1是“phosphataseandtensinhomologpseudogene1(functional)”.而对于未知功能的lncRNA应依据基因组上下文来命名，下图则给出了系统化的命名的规则。如果有一个很接近的蛋白编码基因，lncRNA的名字应该以这个编码基因名字开始，再加后缀即可。后缀的分类：反义（antisense，AS），eg:BACE1-AS；内含子(intronic，IT），eg:SPRY4-IT1；重叠（overlapping，OT），eg:OSX2-OT；长链基因间lncRNA（LongintergeniclncRNAs，lincRNAs），以LINC为前缀，数字为后缀，eg:LINC00485。此外，有些lncRNA与编码基因是头碰头（headtohead），可推断它们拥有双向启动子，HGNC推荐将其命名为反义上游（Antisenseupstream，AU），例如，GENE2-AU1。lncRNA特征通常较长，具有mRNA样结构，经过剪接，具有polyA尾巴与启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方方式.启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog,CREB,Sp1,c-myc,Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征.大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性.在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式.序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到.

LncRNA在生物体内的功能

生物学功能：与表观遗传调控、转录调控、转录后调控、miRNA调控、细胞分化及发育等密切相关；应急功能：可作为细胞内各种信号招募蛋白形成复合物参与免疫反应和宿主防御。LncRNA与疾病：与人类许多疾病，尤其是与衰老相关疾病有密切关系，例如心血管疾病、阿尔兹海默症、糖尿病、癌症等.LncRNA未来能否作为分子靶标成功应用于临床诊断和癌症治疗，是发展的难点与热点.lncRNA表达特异性LncRNA与临床疾病的关系大量研究表明，lncRNA从转录和转录后水平参与蛋白质编码基因调控，其中包括发育相关基因及疾病发生相关基因。通过参与调控蛋白质编码基因，lncRNA既能影响细胞内信号转导途径，也能影响生物体发育过程中的信号转导通路。lncRNA（ATXN80S)在RNA水平上参与8型脊髓小脑共济失调证的（spinocerebellarataxiatype8,SCA8)的发生。LncRNA失调有望成为人类复杂性疾病发病的主要原因。

LncRNA对基因表达的调控LncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现对基因表达的调控LncRNA的顺式和反式调控作用1.LncRNA筛选通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析;通过生物信息学方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因;通过PCR或NorthernBlot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。2.LncRNA全长克隆可以通过5'RACE获取lncRNA5'全长，3'RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。3.

表达分析细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。LncRNA的一般研究策略

4.功能研究功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体。原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响。可通过RNApulldown、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNAtrans和cis作用机制。lncRNA测序实验流程采用配体指数级富集系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移。采用快速预测RNA与蛋白质相互作用与结构域（catRAPID）在线算法来预测RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNA和蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾向。采用非编码RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技术对lncRNA进行功能缺失（Loss-of-function）研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA（esiRNA）和荧光原位杂交（FISH）2种现有研究方法的基础上建立起来的。5.表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。染色质重塑：lncRNA表观调控。ceRNA机制：研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之间的调控机制。内源性竞争RNA（competingendogenousRNAs，ceRNA）揭示了一种RNA间相互作用的新机制。已知miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过竞争性地结合miRNA来调节基因表达。ceRNA可以结合miRNA响应元件（microRNAresponseelements，MREs)影响miRNA导致的基因沉默。LncRNA的一般研究实验手段

与蛋白质的相互作用识别lncRNA的蛋白质伙伴，可以为它们的功能的机制和路径提高线索。RNA结合蛋白免疫沉淀（RNABindingProteinImmunoprecipitation，RIP）技术，如chemical-cross-linkedRIP、nativeRIP(nRIP)、UV-crosslinkedimmunoprecipitation(CLIP)等通过使用抗体来pulldown核蛋白复合物，然后从中分离相关RNA用于分析。每个变体都有它各自优势和缺陷。nRIP提供交联产物，而CLIP在避免交联产物的重新组合的同时用于识别RNA与蛋白质相互作用位点。这些技术可以结合高通量测序，如RIP-Seq、HITS-CLIP/CLIP-Seq，来识别lncRNA相互作用的全部宿主蛋白质因子，尽管还需要技术手段的确认。与DNA的相互作用

以染色体免疫共沉淀(ChIP)和RIP技术的原理为基础，使用染色体RNA免疫共沉淀(ChRIP)来识别与特殊染色体标签相互作用的RNA。另一方面，chromatinoligo-affinityprecipitation(ChOP)、chromatinisolationbyRNApurification(ChIRP)、capturehybridizationofRNAtargets(CHART)使用标记的互补寡核苷酸来识别与目的RNA相互作用的DNA位点。结构特征

lncRNA可以形成特殊的二级和三级结构来执行它们的功能。通过selective2’-hydroxylacylationanalyzedbyprimerextension(SHAPE)和in-lineprobing来获得局部核苷酸柔性。SHAPE可用于高通量分析，如SHAPE-Seq，连接其它依赖于RNA酶消化的技术，如fragmentationsequencing(FragSeq)和parallelanalysisofRNAstructure.

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