实验高效液相色谱法

实验高效液相色谱法第一页，共三十二页，2022年，8月28日1.掌握高效液相色谱法测定饮料中糖精钠、苯甲酸和山梨酸的原理和方法

2.熟悉高效液相色谱仪的使用方法

3.了解高效液相色谱仪的仪器结构[目的与要求]第二页，共三十二页，2022年，8月28日[方法原理]

在适宜的条件下,高效液相色谱可同时分离饮料中的糖精钠、苯甲酸、山梨酸。样品超声除去二氧化碳和乙醇,调pH至近中性,过滤后进高效液相色谱仪,经反相C18液相色谱分离后,紫外检测器230nm波长处检测。

以色谱峰的保留时间定性,利用色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量第三页，共三十二页，2022年，8月28日1.仪器:

高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器;

超声波清洗仪;50ml容量瓶;50ml烧杯;50µl微量进样器[仪器与试剂]第四页，共三十二页，2022年，8月28日

糖精钠标准储备溶液(10.0mg/ml):

准确称取于120℃烘干4h后的糖精钠(C6H4CONNaSO2·2H2O)0.5000g,加水溶解后定容至50ml

苯甲酸标准储备溶液(5.0mg/ml):

准确称取0.2500g,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶解,

定容至50ml

山梨酸标准储备溶液(5.0mg/ml):

准确称取0.2500g山梨酸,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶解,定容至50ml

标准混合使用液

(含糖精钠1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):准确吸取各标准储备溶液5.0ml,加水定容至50ml2.试剂:

稀氨水(1+1);碳酸氢钠溶液:20g/L;甲醇(色谱纯)第五页，共三十二页，2022年，8月28日2.配制标准系列:

取9只50ml容量瓶分别编上号码,按下表配制标准系列。

编号012345标混液(ml)0.001.252.551020蒸馏水(ml)50.048.7547.5454030第六页，共三十二页，2022年，8月28日标混号苯甲酸(mg/mL)A苯甲酸山梨酸(mg/mL)A山梨酸糖精钠(mg/mL)A糖精钠000000010.01254380870.01257343030.02554975620.0258530790.02514735790.05112703330.0516729440.0529072820.1224629940.133921910.159096180.2459902550.267411970.2117674600.49167288

混合标样中各物质的浓度第七页，共三十二页，2022年，8月28日样品苯甲酸山梨酸糖精钠标准曲线方程Y=3×107X-55.2Y=6×107X-37513Y=2×107X-53409r111线性范围(mg/mL)0～0.20～0.20～0.4第八页，共三十二页，2022年，8月28日1.样品处理:吸取10.00～20.00ml汽水,放入50ml烧杯中,超声除去二氧化碳,用稀氨水调pH7.0,加水定容至50ml,用滤膜(0.45µm)过滤,备用。[操作步骤]第九页，共三十二页，2022年，8月28日1.插好电极,打开电源开关,按模式键切换到pH测量状态2.用两点法进行校正(b=2)(pH4.01,6.86,9.18)3.按模式进入b=24.将电极浸入标准缓冲液中(pH=6.86),按“校正”,当到达终点时显示屏上显示相应校正结果;将电极放入第二种标准缓冲液(pH=4.01或9.18),按“校正”,当到达终点时显示屏上显示相应校正结果;按“读数”,保存校正结果并退回到正常的测量状态5.将电极插入到被测液中,调节pH到所需值pH计的使用第十页，共三十二页，2022年，8月28日(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。前处理滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂第十一页，共三十二页，2022年，8月28日3.测定色谱条件:

色谱柱:C18,4.6mm×150mm;流动相:

甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95);流速:1ml/min检测波长:230nm

取样品处理液和标准系列溶液各10µl注入高效液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归方程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中被测物质的含量,按下式计算:第十二页，共三十二页，2022年，8月28日式中:Cx为样品中被测物的含量,g/kgC为在标准曲线上查得的相对应的糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/mlV0为样品定容体积,mlV为取样体积,ml第十三页，共三十二页，2022年，8月28日[思考题]1.为什么被测溶液需要除去二氧化碳?2.采用230nm为测定波长,对样品中山梨酸的测定有何影响？第十四页，共三十二页，2022年，8月28日[注意事项]1.流动相使用前必须经过脱气。如果流动相中含有气体,在较高的柱压下会产生气泡,使流动相流动受阻,对分离样品产生不利影响2.应通过预实验调整和最后确定流动相实际配比,以使各分析组分的分离效果最佳3.被测溶液pH值对测定和色谱柱使用寿命均有影响,以中性为宜4.苯甲酸、糖精钠的灵敏波长为230nm,山梨酸灵敏波长为254nm,在此波长测定时苯甲酸和糖精钠的灵敏度较低,因此采用230nm为测定波长第十五页，共三十二页，2022年，8月28日(2)脱气：

除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

气泡对测定的影响：

1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积

2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形

3）检测器中的气泡产生基线波动A.示差折射率检测器*使折射率变化B.UV检测器（200nm以下）*溶解氧气有吸收C.荧光检测器*溶解氧气有消光作用第十六页，共三十二页，2022年，8月28日1.吸气器法（流动相抽滤）

*可以抑制制做流动相时产生的气泡

*只是暂时的脱气法

*不能解决因溶解气体造成的问题2.超声脱气法3.使用氟树脂膜的减压脱气法溶剂前处理-脱气第十七页，共三十二页，2022年，8月28日★使用超声波震荡器，一般超声震荡15分钟左右★注意流动相在超声震荡脱气过程中，温度会升高，应待其降至室温后再上机使用。★由于液体对气体的溶解作用，时间长后气体会再溶入流动相中，应引起注意。溶剂前处理-脱气第十八页，共三十二页，2022年，8月28日溶剂前处理-脱气使用氟树脂膜的减压脱气法氟树脂膜真空室真空泵流动相往送液泵第十九页，共三十二页，2022年，8月28日缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:

用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min用纯水冲洗泵头清洗管路易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液第二十页，共三十二页，2022年，8月28日第二十一页，共三十二页，2022年，8月28日流动相的更换不互溶的流动相不能直接更换缓冲盐不能直接用有机溶剂更换水正己烷异丙醇缓冲盐有机溶剂水第二十二页，共三十二页，2022年，8月28日液相色谱简易流程图输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器溶剂数据处理废液第二十三页，共三十二页，2022年，8月28日液相系统维护流程图吸滤头单向阀柱塞密封圈线路过滤器手动进样器检测器色谱柱第二十四页，共三十二页，2022年，8月28日泵工作示意图

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