第七章 免疫组织化学技术

免疫组织化学技术AlbertHewettCoons（1912—1978）20世纪40年代Coons利用FITC标记抗体成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原，标志着免疫组化技术的诞生。免疫组织化学技术

（Immunohistochemistry）免疫学技术与组织化学技术相结合的产物，它以抗原抗体特异性反应为基础，并结合化学的呈色反应，最后在组织/细胞层面原位显示跟踪物质的位置，综合反映了静态的组织细胞形态和组成以及动态的机体功能代谢生理状态。第九章免疫组织化学技术第一节免疫组织化学技术的类型第二节免疫组织化学技术基本流程第九章免疫组织化学技术第一节免疫组织化学技术的类型第二节免疫组织化学技术基本流程免疫组织化学技术的类型按标记物的不同分类按反应方式的不同分类按应用方式不同分类1．按标记物的不同分类（1）免疫荧光组织化学技术

（immunofluorescencecytochemistry）（2）免疫酶组织化学技术

（immunoenzymaticcytochemistry）（3）免疫铁蛋白组织化学技术

（immunoferritincytochemistry）（4）免疫胶体金组织化学技术

（immuno-colloidalgoldcytochemistry）（5）放射免疫组织化学技术

（radio-immunocytochemistry）２．按反应方式的不同分类（1）直接标记法（directlabeling）（2）间接标记法（indirectlabeling）（3）抗体桥联法（immunobridge）（4）抗酶抗体法（peroxidase-antiperoxidase）（5）半抗原夹心法（haptensandwich）（6）葡萄球菌蛋白介导的免疫组织化学方法

（proteinAimmunocytochemistry）（7）生物素-亲合素系统介导的免疫组织化学方法

（biotin-avidinsystemcytochemistry）3．按应用方式不同分类（1）免疫电镜组化技术

（immunoelectromicroscopycytochemistry）（2）双标记或多重染色组化技术

（doublelabelingcytochemistry）（3）定量免疫组化技术

（quantitativeimmunocytochemistry）（4）原位杂交与免疫组化技术（insitehybridizationandimmunocytochemistry）第九章免疫组织化学技术第一节免疫组织化学技术的类型第二节免疫组织化学技术基本流程免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析组织的取材动物标本手术活检标本尸体解剖标本细胞标本动物的处死空气栓塞法麻醉法断头法颈椎脱臼股/颈动脉放血法取材注意事项迅速干脆注意保持组织的完整性和代表性活检标本注意区别病变组织、边缘组织和正常组织肾穿刺标本小标本细胞的取材

（Drawingmaterials）印片穿刺涂片体液沉淀涂片培养细胞组织切片技术冰冻切片石蜡切片取材固定洗涤和脱水透明浸蜡包埋切片与粘片烤片

脱蜡水化染色封片

固定

（Fixation）将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质尽量接近于原始状态的形态结构和位置。组织细胞的固定

（Fixation）要求：完整性、天然性、抗原性、便于后期操作策略：快速脱水、阻断酶活、保持抗原性试剂：醛、醇、酮、酸方法：浸泡法、灌流法、微波固定法抗原分类不稳定抗原细胞表面标志半稳定抗原B细胞表面IgG较稳定抗原小分子蛋白，多肽类常用固定液简单固定液福尔马林（4%甲醛）、乙醇（80-95%）、氯化汞（5-7%）、苦味酸（0.9-1.2%）、重铬酸钾（1-3%）、铬酸（0.5-1%）、锇酸（1-2%）、丙酮混合固定液中性甲醛、乙醇甲醛、4%多聚甲醛-磷酸缓冲液、4%多聚甲醛-氢氧化钠、Carnoy液（冰醋酸、氯仿、乙醇）、Bouin液（苦味酸、甲醛、冰醋酸）、Zenker液（升汞、重铬酸钾、蒸馏水、冰醋酸）、PLP（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛）固定剂选择血涂片：丙酮，福尔马林（胞质蛋白，BCR）细胞涂片：95%乙醇、carbowax.冰冻切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛石蜡切片：福尔马林（需抗原修复）、氯化汞（胞浆蛋白）PLP/PLDP（糖类、脂类）、乙醇、丙酮固定方法浸泡法蒸汽法注射、灌注法微波固定注意事项固定液的量固定的条件（温度、浓度、时间）组织提取组织块的体积固定后的清洗组织的脱水目的：去除组织中的水分，便于后期的有机溶剂处理。方法：有机溶剂逐级吸收试剂：乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇、环己酮、松脂醇组织的透明目的：便于浸蜡包埋方法：逐级浸泡试剂：二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油、苯甲酸甲酯、苯胺油浸蜡、包埋一般光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂组织切片载玻片处理黏片剂明矾-明胶、多聚赖氨酸、树脂、甲醛-明胶等免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析抗原抗体反应抗原的暴露和修复酶消化技术热诱导修复技术抗体孵育抗原修复抗原修复缓冲液0.01MTRIS-HCLPh1/10胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶（细胞间抗原）、链霉蛋白酶、无花果蛋白酶热诱导修复微波、灭菌锅、蒸汽、压力锅、水浴70-100度（10-60min）注意事项：自然冷却、避免蒸干、条件统一，结构改变，适当加入螯合剂免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析染色策略ABCPROCEDUREUTILIZINGCATALYZEDSIGNALAMPLIFICATION(CSA)biotinyl-tyramide显色系统DAB显色液AEC显色液（显色为红色）Hanker-yater试剂（蓝黑色）TMB显色液（脂溶性，显色为蓝色）显色效果的提高蛋白酶消化抗原修复高敏感显色方法的使用放射免疫组织化学技术免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术免疫酶组织化学技术双标记或多重染色组化技术免疫电镜组化技术原位杂交技术膀胱癌和癌旁组织上用ADAM12T3反义探针检测到阳性杂交信号(C,D)，而正义探针在癌旁的正常组织中只见到很弱或阴性信号(E,F)。D和F分别是C和D的黑视野图像。免疫组化定量免疫组化技术免疫组织化学技术基本流程一、样品的制备二、抗原抗体反应三、化学呈色反应四、免疫组织化学结果及其分析染色对照表达特异性阴性结果判断出血、坏死、边缘部位的判定综合评价染色结果四、免疫组织化学结果及其分析阳性对照阴性对照阴性组织阴性试剂（无关抗体、反向吸收、抑制试验）自身对照对照的设定非特异性染色组织内源性干扰标记物干扰抗体干扰组织处理不当组织内源性干扰自发和诱发荧光胶原纤维和弹力纤维蓝绿色软骨和角蛋白呈黄绿色脂褐素呈棕黄色甲醛固定后的肾上腺素，5羟色胺组织内源性干扰内源性过氧化物酶内源性生物素标记物干扰荧光素（F/P>2）HRP（RZ>3）亲和素（优先使用链霉亲和素）抗体干扰抗体的非特异吸附免疫原的交叉反应IgG之间的交叉反应天然抗体交叉反应组织处理不当血清及分泌性抗原干扰组织固定不及时流程操作不规范非特异性荧光的消除衬染法（伊文思蓝抑制自发荧光）荧光抗体（纯化）胰蛋白酶消化吸收血清孵育双重标记提高抗体质量非特异性染色的消除抗体特异性不好：提高免疫抗原纯度，组织吸收，采用单克隆抗体连接抗体：提高二抗纯度酶标抗体：避免Fc受体的结合，醛基的着色DAB：含有杂质及沉淀抗体浓度：结缔组织假阴性结果试剂缺少二抗不匹配抗体失效抗体浓度过低抗体干涸抗原修复失败酶处理时间太长染色时间过短，酶活性小叠氮化钠抑制HRP显色液失效显色缓冲液冲突阳性对照错误阳性不强固定不当抗体反复冻融抗体浓度过低缓冲液残留过多抗原修复不彻底底物失效显色时间过短，叠氮化钠干扰缓冲液不匹配复染、脱水、封片剂与显色系统的干扰抗原表达少

染色过强抗体浓度过高显色时间过长组织封闭效果不好洗涤时间及次数不够过氧化氢阻断不足切片上的杂质洗涤不彻底DAB析出二甲苯不及时更换固定时间过长燃料沉淀抗原未按预期表达封闭不当一抗过高二抗交叉反应蛋白酶消化过度抗原热修复过度