电泳法和高效毛细管电泳法

第10章电泳法和高效毛细管电泳法

(ElectrophoresisandHighPerformanceCapillaryElectrophoresis,HPCE)毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。20世纪30－40年代蒂塞利乌斯(A.W.K.Tiselius）建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术获得1948年诺贝尔化学奖

1981,实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。

毛细管电泳的原理

1装置

毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液缓冲液

高压电源

（可高至30KV）

第10章电泳法和高效毛细管电

分离模式1毛细管区带电泳2胶束电动毛细管色谱3毛细管凝胶电泳

4亲和毛细管电泳5毛细管电色谱6毛细管等电聚焦电泳7毛细管等速电泳第10章毛细管电泳分离模式

1毛细管区带电泳（CZE）

也称为毛细管自由溶液区带电泳毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体

第10章毛细管电泳分离模式

2胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术胶束电动毛细管色谱MECC:是以胶束为假固定相的一种电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合加入高于胶束临界浓度的表面活性剂胶束电动色谱的应用特点:使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离中性化合物.比高效液相色谱更为高效.HPLC分离柱效为5000－25000理论板数/mMECC可达到50000－500000理论板数/m比高效液相色谱更为高速.MECC分离时间通常小于30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时间。

第10章毛细管电泳

分离模式

第10章毛细管电泳分离模式

3毛细管凝胶电泳CGE

是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式

用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离

毛细管凝胶电泳的特点：综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点，电泳峰尖锐，柱效极高短柱上实现极好的分离试样容量为10－12g主要缺点:制备柱较困难，寿命较短

已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。第10章毛细管电泳分离模式

第10章毛细管电泳分离模式

5毛细管电色谱CEC:以电渗流驱动流动相，开管和填充两种，通常填充或涂布固定相比高效液相色谱具有更高的柱效

第10章毛细管电泳分离模式

6毛细管等电聚焦CIEF:建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法，通过建立pH值梯度。蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。

进样－等电聚焦－检测先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦.在阳、阴极电解液中加入盐如NaCl或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。第10章毛细管电泳分离模式

毛细管等电聚焦的实验方法:

毛细管等电聚焦特点:等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这一过程可用于浓缩试样组分。具有极高的分辩率，可以分离等电点相差0.01pH的两种蛋白质.注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定

第10章毛细管电泳分离模式

第10章毛细管电泳分离模式

7毛细管等速电泳分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同，等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解质溶液和终结(后继）电解质溶液，分离后的各组分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。等速电泳所要求的条件:

1.特殊的电解质系统:

在毛细管等速电泳中,用有效淌度比样品中任何离子的有效淌度都大,并具有一定缓冲能力的离子作为前导电解质(leadingelectrolyte),加入到末端(检测端)电解槽和毛细管中,用有效淌度比样品中任何离子的有效淌度都小,并具有一定缓冲能力的离子作为尾随电解质(terminatingelectrolyte)

加入起始端电解槽中.样品加在前导电解质和尾随电解质之间.系统中要加入对离子,以满足电中性的要求.区带电泳和等速电泳使用的电解质溶液的不同在区带电泳中，整个系统都用同一种电解质充满，这种电解质被称为背景电解质或支持电解质。它运载电流并有一定的缓冲能力。在等速电泳中，不加入这样的背景电解质。

2.背景电流要小到足以克服区带电泳效应

在毛细管等速电泳中,由于没有一个背景电解质支持电流(毛细管等速电泳要求溶剂的自身电导可以忽略不计),各区带互相连接.

毛细管等速电泳一般用恒流操作模式.

分离开始后,在电压的作用下,各组分由于淌度的不同被分离.

系统通电后,样品中迁移速度最大的离子运动最快,但慢于前导电解质.迁移速度最小的离子运动最慢,但快于尾随电解质,具有不同淌度的离子得到分离。

恒稳态时所有区带具有相同的移动速度.第10章毛细管电泳

10.2.3理论效率及表示方法

1.理论塔板高

H=L/N

N=5.54(tR/W½)2实验上可按上式求出理论塔板数W½为电泳峰的半峰宽

2.分离度（Rs），1毛细管电泳系统：高压电源（可高至30KV）毛细管数据处理检测器电极电极缓冲液试样缓冲液基本结构：高压电源、电解液槽和进样系统、毛细管及恒温装置、检测器、数据处理装置10.3电泳仪和高效毛细管电泳仪⑴高压电源:0-30kv连续可调的直流高压电源

⑵毛细管柱：内径25-75μm,常用50和75μm

材料：石英为主，长度30-70cm,

凝胶柱20cm左右。基本结构：（3）进样方法Ⅰ电动力学进样也称电迁移进样.样品方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中，试样管中插入电极，与检测端的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲液，电泳即可进行。电极电极样品压力样品真空样品虹吸Ⅱ流体动力学进样A进样端加压B检测端出口减压C虹吸进样流体动力学进样优点：1.若严格控制样品的黏度和温度，则进入毛细管的量是固定的；2.在进样中没有进样歧视。ABC(4)检测器检测器检出限（mol/L）特点UV－可见吸收10-5－10-6

近似通用，常规应用荧光非相干光诱导10-7－10-8

灵敏，但试样通常要衍生激光诱导10-10－10-12

高灵敏度，价格贵，要衍生化电化学

电导10-5－10-7

通用性安培10-8－10-9

选择性，灵敏度高，微量质谱10-7－10-9

仪器复杂，可获结构信息，质量灵敏度高放射10-9－10-11

灵敏度高，操作有特殊要求(4)检测器检测器检出限（mol/L）特点UV－可见吸收10-5－10-6

近似通用，常规应用荧光非相干光诱导10-7－10-8

灵敏，但试样通常要衍生激光诱导10-10－10-12

高灵敏度，价格贵，要衍生化电化学

电导10-5－10-7

通用性安培10-8－10-9

选择性，灵敏度高，微量质谱10-7－10-9

仪器复杂，可获结构信息，质量灵敏度高放射10-9－10-11

灵敏度高，操作