核酸分离与纯化

1核酸是分子生物学实验的主要研究对象，许多分子生物学实验的第一步都要进行核酸的提取，如PCR、基因测序及分子克隆等.提取核酸的种类:真核细胞基因组DNA、质粒DNA、总RNA及mRNA第1页/共32页2

提取的核酸样品的完整性和纯度直接关系到最后实验的结果鉴定技术:

分光光度技术:样品定量、纯度鉴定凝胶电泳技术:样品定量、纯度鉴定分子量测定、分离核酸片段第2页/共32页3第一节核酸分离与纯化的基本过程一、材料与方法

1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞

2.方法：保证核酸一级结构的完整性原则排除其他分子的污染，保证样品的纯度第3页/共32页4二、技术路线

1.核酸的释放

破碎细胞，释放核酸

方法：机械法破坏线性DNA

非机械法

2.核酸的分离与纯化大分子污染物污染物非需要的核酸分子对后续实验有影响的溶液和试剂

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3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤浓缩:

沉淀：有机溶剂沉淀法原理：

洗涤：用70％～75％乙醇去除沉淀中的盐第5页/共32页6

4、鉴定与保存

1.）核酸的鉴定浓度、纯度、完整性

①浓度鉴定

a紫外分光光度法260nm

在标准条件下，1个吸光度单位相当于

50g/ml的双链DNA38g/ml的单链DNA或RNA33g/ml的单链寡聚核苷酸

b荧光光度法

荧光染料：溴化乙锭

发出橙红色荧光

第6页/共32页7

②纯度鉴定

a紫外分光光度法：测A260／A280的比值判断是否有蛋白质污染

（为什么）

A260／A280比值为1.8，纯DNAA260／A280比值为2.0,纯RNAb荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核酸电泳结果判断纯度第7页/共32页8

③完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸电泳结果判断完整性。

2）核酸的保存

①

DNA的保存

pH影响DNA稳定性pH7.0~8.0EDTA减少二价金属离子氯仿防止细菌污染温度低温-70℃保存数年

4℃保存第8页/共32页9

②

RNA的保存

a0.3mol／L的醋酸钠或双蒸水，-70℃～-80℃。若加入RNA酶抑制剂可延长保存时间。

b将RNA沉淀溶于70％乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20℃可长期保存。

小量分装保存第9页/共32页10第二节基因组DNA的分离与纯化一、分离与纯化的方法

1.酚抽提法:EDTA裂解缓冲液SDS裂解细胞蛋白酶KRNA酶

pH8.0的Tris饱和酚抽提醋酸铵、无水乙醇沉淀70％乙醇洗涤DNA

第10页/共32页11第11页/共32页122.DNA样品的进一步纯化方法:透析、层析、电泳、选择性沉淀聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第12页/共32页13二、DNA片段的回收

(一)原则与要求

1.提高DNA片段的回收率

2.除去回收DNA样品中的污染

(二)回收方法：

1.DEAE纤维素膜插片电泳法琼脂糖凝胶

2.电泳洗脱法

3.压碎与浸泡法聚丙烯酰胺凝胶第13页/共32页14第三节质粒DNA的提取与纯化一、提取与纯化基本过程：细菌培养细菌裂解提取质粒

1.提取方法：碱裂解法煮沸裂解法

SDS裂解法

2.纯化方法：氯化铯-溴化乙锭等密度梯度超速离心法（CsCI-EB法）聚乙二醇沉淀法第14页/共32页15

裂解细胞细胞蛋白质、染色体变性释放质粒DNA调pH中性质粒DNA恢复天然结构沉淀（质粒DNA溶于上清液中）取上清液无水乙醇沉淀质粒DNA70％乙醇洗涤质粒DNApH12.0~12.6高浓度盐第15页/共32页16第16页/共32页17二、质粒DNA的回收提取纯化的质粒DNA凝胶电泳回收第17页/共32页18第四节RNA的分离与纯化rRNA80~85%tRNA15~20%总RNAmRNA1~5%

mRNA一、RNA制备的条件与环境

RNase

注意：1.细胞外RNase的污染

2.

抑制细胞内RNase

第18页/共32页19措施：1.洁净的实验室

2.戴手套与口罩

3.一次性的实验材料和新包装的试剂

4.玻璃器皿用DEPC处理

5.冰浴条件下进行操作第19页/共32页20二、总RNA的分离与纯化（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法硫氰酸胍+β-巯基乙醇裂解细胞酚／氯仿抽提裂解溶液异丙醇沉淀75％乙醇洗涤RNApH4.0第20页/共32页21三、mRNA的分离与纯化

细胞内mRNA特点：含量少种类多分子大小不一

mRNA结构特点：多聚腺苷酸尾（polyA）方法：oligo(dT)-纤维素柱层析法

oligo(dT)-纤维素液相结合离心法第21页/共32页22第22页/共32页23第五节DNA测序

主要方法:

双脱氧末端终止法

Maxam-Gilbert化学降解法

DNA自动化测序第23页/共32页24一、双脱氧末端终止法原理：模板：单链DNA（待测序的DNA）酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

引物：5｀端标记的寡核苷酸链底物：dNTP(AGCT)

ddNTP(AGCT)第24页/共32页25

反应体系：四组独立的反应体系每组均含有dNTP(AGCT)

ddNTP(一种)

操作：

1.获得标记片段组

2.电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.显影

4.读序第25页/共32页26第26页/共32页27第27页/共32页28二、Maxam-Gilbert化学降解法

待测DNA标记四组独立反应体系针对某一种碱基进行切割第2