人工合成多聚核苷酸体外翻译技术

第六章蛋白质的生物合成蛋白质生物合成又称翻译（translation），是指由RNA参与的蛋白质生物合成的过程，它将核酸的碱基序列转变为蛋白质中的氨基酸序列。参与翻译的RNA分子有tRNA、rRNA和mRNA。tRNA的功能是转运氨基酸，rRNA与多种蛋白质组成核糖体作为翻译进行的场所，mRNA作为翻译的模板。经过三种RNA以及多种蛋白质的相互作用，使来自DNA的遗传信息正确地传递到蛋白质。第一节遗传密码一、遗传密码遗传密码（geneticcode）是联系核酸的碱基序列和蛋白质的氨基酸序列的途径。mRNA上由三个碱基代表一种氨基酸，称为密码子（codon）。生物体内存在多个密码子代表一种氨基酸的情况。1954年，物理学家GeorgeGamov根据在DNA中存在四种核苷酸，在蛋白质中存在二十种氨基酸的对应关系，提出三个核苷酸为一个氨基酸编码是最理想的。因为在有四种核苷酸的条件下，64（43=64）是能满足为20种氨基酸编码的最小数，这也符合生物体在亿万年进化过程中形成的和遵循的经济原则。密码子的破译是分子生物学发展史上的一件大事。主要运用了两项技术，一项是1961年由Nirenberg等报道的人工合成多聚核苷酸体外翻译技术；另一项是1964年Nirenberg和Leder发明的核糖体结合技术。这两项技术的出现，为密码子的破译奠定了基础。

破译密码的实验研究先后由三个实验室逐步发展了四种破译方法，于1965年完成。

1)在体外无细胞蛋白质合成体系中加入人工合成的polyＵ开创了破译遗传密码的先河。1961年，美国NIH的Nirenberg和Mathaei第一次确认了UUU是Phe的密码子。随后他们又确定了AAA是Lys的密码子，CCC是Pro的密码子。2)混合共聚物(mixedcopolymers)实验对密码子中碱基组成的测定1963年，Speyer和Ochoa等发展了用两个碱基的共聚物破译密码的方法。例如以A和C原料，合成polyAC。但这个方法不能确定碱基的排列方式，而只能显示密码子中碱基组成及组成比例。另外，通过反复改变共聚物成份比例的方法亦十分麻烦和费时。

3)aa-tRNA与确定的三核苷酸序列(密码子)结合（核糖体结合技术）Nirenberg和Leder于1964年建立了破译密码子的新方法，即tRNA与确定密码子结合实验。即是在缺乏蛋白质合成所需的因子的条件下，特异氨基酸-tRNA(aa-tRNA)也能与核糖体-mRNA复合物结合。最重要的是这种结合并不一定需要长的mRNA分子。但有一些三核苷酸序列与核糖体结合并不象UUU或GUU等那样有效。4)用重复共聚物(repeatingcopolymers)破译密码Jones，和Khorana等人应用有机化学和酶学技术，制备了已知的核苷酸重复序列。蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始，并把特异的氨基酸参入肽链。例如，重复序列CUCUCUCUCU......是多肽Leu-Ser-Leu-Ser......或者是多肽Ser-Leu-Ser......的信使分子。除甲硫氨酸和色氨酸外，其他的氨基酸均有两种以上的密码子。多种密码子编码一种氨基酸的现象称为简并（degeneracy），代表同一种氨基酸的密码子称为同义密码子（synonyms）。氨基酸的密码子数目和它在蛋白质中出现的频率并没有明显的正相关性。一种氨基酸的几个密码子的差异通常在第三个碱基，说明了密码子的第三个碱基具有一定的灵活性。在所有的生物体内，密码子字典几乎是通用的，这已被体内和体外的翻译实验所证实。线粒体的遗传密码子存在较多的例外情况，其中最常见的一种变化是UGA由终止密码子变为色氨酸的密码子，这可能是进化上最早期的变化。二、密码子和反密码子的相互作用密码子决定氨基酸是通过mRNA与tRNA相互作用实现的，这种作用实质上是碱基间的配对。密码子与反密码子（anticodon）间的正确识别是遗传信息正确传递的保证。一般来说，生物体内tRNA的种类要少于编码氨基酸的密码子。密码子的前两位碱基在和反密码子配对时遵循Watson-Crick原则，而第三位碱基则有一定的灵活性，这就是摆动假说（wobblehypothesis）。在不同生物体内，存在多种方式使少数的tRNA识别61种编码氨基酸的密码子，不同的生物所采用的途径也不同。tRNA分子中含有较多的修饰碱基。位于反密码子中的或其他位置的修饰碱基均会对密码子和反密码子的作用产生影响。第二套密码系统的概念和特征1988年，ChristiandeDuve在Hou和Schimmel等人的研究基础上，提出了第二套密码系统的概念或学说。该学说认为:tRNA氨基酸接受柄有一辅密码区(paracodonregion)，可以被氨基酰tRNA合成酶(aaRS)识别，并决定tRNA的负载特异性。他认为第二套密码系统蕴含于aaRS结构中。与经典密码系统不同。辅密码子密码系统或第二套密码系统是非简并性的(non-degenerate)。可能只有20种aaRS，每种aaRS能够识别特异于某种氨基酸的所有tRNA，这种识别与该种特异tRNA的不同特征有关。第二套密码系统比经典的密码系统对氨基酸更具有决定性，这与辅密码子和相应的氨基酸间的立体化学相互反应有关。

ChristiandeDuve认为，第二套密码系统仅仅是辅密码子与aaRS-aa-AMP或aa-aaRS复合物的一个简单反应，而tRNA则起着删除错误氨基酰的作用。aaRS上的某些区域含有一些残基可与辅密码子的核苷酸反应，但无法把所有氨基酸侧链与tRNA的核苷酸匹配起来。因此，一些科学家提出第二套密码系统存在于tRNA分子本身，而不应存在于aaRS结构中。第二套密码系统比经典的密码系统更原始。一些作者猜测tRNA起源于携带氨苷酰的寡核苷酸，其原始形式能与氨基酸直接反应。破译第二密码系统的意义不仅仅限于tRNA分子本身生物学功能的认识，更重要的是将对生物化学，生物起源，分子生物学及遗传学产生重大影响。

第二节tRNA的功能所有的tRNA都有相同的二级（三叶草型）和三级结构（倒L型）。这种结构上的一致性是其功能所必需的。因为不同的tRNA分子都具有相同的功能特征。tRNA在翻译中转运氨基酸的作用，将氨基酸经过密码子与反密码子的相互识别定位在肽链中。从这一点上看，tRNA是起具体翻译作用的分子。一、氨酰tRNA合成酶氨酰tRNA合成酶催化氨基酸与tRNA之间的反应。携带同一种氨基酸的tRNA可有多种，称为同工tRNA（iso-acceptingtRNA）。可将tRNA分为20个同工tRNA组。一组同工tRNA在特定的合成酶催化下与相应的氨基酸结合。氨酰tRNA合成酶有三个结合位点，分别是氨基酸结合位点、ATP结合位点和tRNA结合位点。它催化的反应可分为两步：第一步氨基酸和ATP形成腺苷酸化氨基酰，释放焦磷酸；第二步活化型的氨基酸被转移至tRNA，释放AMP。氨酰tRNA合成酶所催化的反应有特异性，即能选择相应的tRNA和氨基酸。一种合成酶只能识别一种氨基酸和该氨基酸的几种同工tRNA。tRNA沿着L型的一面与合成酶结合。所有的tRNA均是以两个端点与合成酶结合，大部分的序列不被合成酶识别。第一类和第二类合成酶与tRNA的相互作用有所区别。经晶体结构分析，两类酶与tRNA接触的方位正好相反，所形成的复合物互成镜像结构。第三节核糖体的结构核糖体（ribosome），又称核糖核蛋白颗粒（ribonucleoproteinparticle），是细胞内进行蛋白质合成的场所，在蛋白质合成中起着中心作用。核糖体提供了蛋白质合成过程中所需的各种生物活性。一、核糖体的组成原核生物、真核生物和细胞器的核糖体组成差别很大，但其三维结构非常相似。不论何种来源的核糖体，均由大小两个亚基组成。两个亚基均由RNA和一定数量的蛋白质组成，其共同特征是RNA的含量比蛋白质高。核糖体RNA（rRNA）的纯化相对比较容易，可以用苯酚抽提核糖体以去除蛋白质而获得。rRNA的大小可以通过超速离心来确定。核糖体蛋白则是非常复杂的混合物，其纯化和分子量的大小只能用更为精细的办法来确定。1970年，E.Kaldschmidt和H.G.Wittman用双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）的办法对组成两个亚基的蛋白进行了近乎完全的解析。

大肠杆菌70S核糖体由30S小亚基和50S大亚基两部分组成。30S小亚基由一个16SrRNA和21种核糖体蛋白组成，而50S大亚基则含有两个rRNA（5S和23S）和34种核糖体蛋白。真核生物细胞质核糖体更为复杂，沉降系数为80S，由40S小亚基和60S大亚基组成。40S小亚基由18SrRNA和33种蛋白组成，而60S大亚基则含有三个rRNA分子（5S，5.8S和28S）和50种核糖体蛋白。组成核糖体的RNA和蛋白质一般只有一个拷贝。RNA和蛋白质相互作用，形成一个复杂而有序的结合体。核糖体的数目与生物合成蛋白质的活性密切相关。二、核糖体的结构核糖体的直径只有可见光波长的十分之一。因此，单个的核糖体不能反射可见光，我们也就不能在光学显微镜下看到核糖体。20世纪70年代，JamesLake（1976）利用负染色电镜技术（negativestainingtechniques）不仅观察到了核糖体两个亚基的形状，还得到了在完整的核糖体内它们是如何配合在一起的信息。30S核糖体亚基结构包括头（head）、基部（base）、平台（platform）以及缝隙（cleft）等；50S核糖体亚基的结构包括中央突（centralprotuberance）、茎（stalk）、嵴（ridge）以及谷（valley）等。核糖体30S小亚基的平台伸入到50S大亚基的谷中而嵌和在一起。游离状态和蛋白质合成过程中的核糖体结构有区别，说明核糖体的结构在蛋白质合成过程中有一定的灵活性。JoachimFrank等（1995）利用一种更高分辨率的技术－冷冻电子显微镜技术对大肠杆菌70S核糖体进行了更为细致的描述。他们利用计算机将4300张图象组合起来，形成了核糖体的三维立体图。他们还观察到了核糖体的几个新特征，包括30S亚基上的一个距（spur）、30S亚基颈部的一个通道（channel）以及起始于两个亚基交界峡谷（interfacecanyon）的分叉隧道（tunnel）。

mRNA经由30S亚基颈部的通道形成一个U型的转弯，在转弯处与两个亚基之间A位点和P位点上的tRNA发生相互作用，最后mRNA通过30S亚基的平台和头之间的缝隙离开核糖体。分叉隧道的作用可能是为新生的多肽链提供了可选择的离开核糖体的通路。最近，核糖体晶体衍射结构领域的研究取得了迅速的进展。不仅表现在两个亚基和整体核糖体的晶体衍射分辨率有了很大的提高，还克服了很多晶体衍射图象的难点问题。两个亚基在原子分辨率水平上的晶体衍射图以及整体核糖体在5.0Å分辨率的分子模型都已经发表。大部分的核糖体蛋白，特别是那些大亚基核糖体蛋白，都有手指状的突起伸到rRNA核心内以稳定rRNA的结构。核糖体蛋白对亚基的rRNA核心起着修饰的作用。核糖体的功能中心是富含RNA的，亚基相互作用的主要位点也是由RNA组成，而核糖体蛋白只在一些小的和更外周的位点形成中发挥作用。解码位点和肽酰转移酶中心都没有蛋白成分。现在已经确定，距离肽酰转移酶中心最近的核糖体蛋白没有催化作用，它们的功能主要是维持活性位点的构象。尽管核糖体的解码和肽酰转移酶中心以RNA为主，核糖体蛋白也发挥着非常重要的作用。没有了蛋白成分，核糖体既不能装配也不会发挥其功能。现在发现在翻译的各阶段均有rRNA的参与，rRNA的正确结构是蛋白质发挥催化功能所必需的。在翻译起始过程中，rRNA的3’端直接与mRNA作用；16SrRNA在A和P位直接与反密码子作用；23SrRNA与肽酰-tRNA的CCA端直接作用；大小亚基的结合可能涉及到16S和23SrRNA间的碱基配对关系。在翻译的各个阶段，抑制翻译的抗生素几乎都作用于rRNA，说明了rRNA的重要性。16SrRNA的二级结构可以分为三个各自独立的折叠结构域：5’、3’和中央结