光学显微镜基础知识

光学显微镜基础知识光学显微镜基础知识显微镜的光学原理象差显微镜的技术参数显微镜的光学部件基础知识第二页，共90页。显微镜成像FF’物镜第三页，共90页。显微镜成像FF’物镜第四页，共90页。显微镜成像物镜250mm＝明视距离FF’目镜第五页，共90页。基础知识光学显微镜基础知识显微镜的光学原理像差显微镜的技术参数显微镜的光学部件第六页，共90页。理想成像点

标本投影图像点平面平面图形准确

相似

图形像差第七页，共90页。实际图形点

标本投影图像虚的圆

平面弯曲的面图形变形的图形像差第八页，共90页。象差的种类球差象散慧差畸变场曲色差基础知识第九页，共90页。象差球差象散慧差场曲负畸变正畸变基础知识第十页，共90页。场曲基础知识基础知识ACHPLANACH第十一页，共90页。场曲

ＡＣＨＰＬ第十二页，共90页。色差基础知识色差校正对照第十三页，共90页。色差校对无校对

校对

第十四页，共90页。基础知识光学显微镜基础知识显微镜的光学原理像差显微镜的技术参数显微镜的光学部件第十五页，共90页。显微镜的技术参数数值孔径分辨率工作距离焦深放大倍率同焦距同轴度基础知识第十六页，共90页。数值孔径()基础知识第十七页，共90页。分辨率基础知识ΔR=kλ/NAΛ：波长NA：数值孔径K常数:K光镜；KFV第十八页，共90页。数值孔径大分辨率高基础知识第十九页，共90页。NA与焦深基础知识第二十页，共90页。工作距离()基础知识第二十一页，共90页。工作距离不需要盖玻片

有盖玻片第二十二页，共90页。同焦距（齐焦距离)基础知识第二十三页，共90页。同轴度基础知识比如10倍物镜下的中心转换到40倍是仍然几乎是中心第二十四页，共90页。柯勒照明和临界照明基础知识第二十五页，共90页。临界照明

柯勒照明基础知识第二十六页，共90页。厚标本和薄标本4-5um2um基础知识第二十七页，共90页。基础知识光学显微镜基础知识显微镜的光学原理像差显微镜的技术参数显微镜的光学部件第二十八页，共90页。显微镜的主要光学部件物镜目镜聚光镜基础知识第二十九页，共90页。物镜基础知识第三十页，共90页。物镜的种类按色差和场曲校正程度分:消色差物镜（Ach)平场消色差物镜(PlanAch)平场半复消色差物镜(Plan-FL或PLFL）平场复消色差物镜（PlanApo)平场超级复消色差物镜（PlanSApo)基础知识第三十一页，共90页。VIS－

NIR范围内优异的色差校正信噪UPLSAPO物镜第三十二页，共90页。消色差Ach –蓝

(486nm)和红

(657nm)半复消色差Fluorite –兰和红

+(绿,紫色(437nm))复消色差Apo –437-657nm超级复消色差SuperApo –430-1000nm物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACH第三十三页，共90页。消色差Ach –蓝

(486nm)和红

(657nm)半复消色差Fluorite –兰和红

+(绿,紫色(437nm))复消色差Apo –437-657nm超级复消色差SuperApo –430-1000nm物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACHFL第三十四页，共90页。IRIR消色差Ach –蓝

(486nm)和红

(657nm)半复消色差Fluorite –兰和红

+(绿,紫色(437nm))复消色差Apo –437-657nm

超级复消色差SuperApo –430-1000nm物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACHFLApo第三十五页，共90页。消色差Ach –蓝

(486nm)和红

(657nm)；绿球差半复消色差Fluorite –兰和红

+(绿,紫色(437nm))；绿、兰球差复消色差Apo –437-657nm，绿、兰、深兰球差超级复消色差 –430-1000nmSuperApo物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACHFLSApoIRIRApo第三十六页，共90页。消色差物镜基础知识复消色差物镜半复消色差物镜第三十七页，共90页。传统物镜的符号基础知识第三十八页，共90页。新物镜的符号基础知识第三十九页，共90页。其它物镜基础知识浮雕相称物镜无应力偏光物镜相称物镜超低倍物镜第四十页，共90页。带校正环物镜基础知识第四十一页，共90页。对载波片和盖玻片厚度的要求基础知识载玻片:0.9-1.4mm盖玻片:0.17mm第四十二页，共90页。无盖片物镜基础知识第四十三页，共90页。物镜光阑的运用光阑全开启光阑适当关小——荧光观察中应用第四十四页，共90页。目镜基础知识第四十五页，共90页。目镜的视场基础知识F.N.22第四十六页，共90页。标本的视场直径标本的视场直径=目镜视场数/物镜倍率

例:WH10X目镜视场数为22物镜为UPLFL40X视场直径基础知识第四十七页，共90页。聚光镜第四十八页，共90页。显微镜的调节瞳距调节屈光度调节光路转换聚光镜中心孔径光栏设置第四十九页，共90页。瞳距调节第五十页，共90页。屈光度调节调节第五十一页，共90页。光路转换100%80%20%100%第五十二页，共90页。聚光镜中心调节⑤光轴中心调节螺钉③视场光阑③孔径光阑②10X物镜①标本④聚光镜升降旋钮第五十三页，共90页。孔径光栏调节N.A聚=(0.6-0.8)N.A物第五十四页，共90页。孔径光栏开度与图象100%70%30%HRLCHCLRMRMC第五十五页，共90页。孔径光栏的运用第五十六页，共90页。孔径光栏的运用对比度调节第五十七页，共90页。奥林巴斯显微镜无限远光学系统——UIS第五十八页，共90页。显微镜无限远光学系统——UIS

有限远无限远UIS光学系统第五十九页，共90页。MeritoftheInfinitysystem

物镜

D/M重影平行光线结像透镜第六十页，共90页。第六十一页，共90页。UIS系统

Universal

Infinity

System————万能无限远系统1.完美结合分辨率和对比度

-明场高分辨率 -高对比度、高亮度图像 -清晰的

DIC图像 -更敏感的偏光观察 -清晰、色彩明亮的相衬第六十二页，共90页。UIS系统Universal

Infinity

System2.系统灵活性 -无限远校正光学系统 -物镜和结像透镜完全校正3.物镜万能性更强 -AsingleuniversalobjectivelensperformsverywellinFluorescence,NomarskiDIC,Phasecontrast,Polarizedlightand,ofcourse,Brightfield -HighUVtransmission,Strain-free,PerfectcorrectionofChromaticaberrationandotheropticalaberrations

第六十三页，共90页。Competitioncomparison

F:FullyPrimaryCorrectioninobjective&tubelens

Tc:Tube-lensCompensation第六十四页，共90页。奥林巴斯显微镜无限远光学系统——UIS增加附件，光路不变，倍率不变，F.N.不变中间附件设计更简单，不需增加透镜物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正）接视频效果更好，不需增加照相目镜第六十五页，共90页。第六十六页，共90页。相差观察方式1原理利用被检物体的光程（折射率x厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共轭面：吸收光线，直射光通过补偿面：相位推迟，衍射光通过物镜相板聚光镜环状光阑第六十七页，共90页。相差观察方式2特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3缺点需要光强高切片不能太厚(2~10um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜第六十八页，共90页。相差观察方式4应用：

无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)第六十九页，共90页。相差观察方式5调节：柯勒照明调节将相差物镜及附件转入光路（物镜－聚光镜相衬环型号匹配）对样品聚焦取下目镜，装上CT望远镜，调节CT焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合第七十页，共90页。荧光观察方法第七十一页，共90页。什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。显微镜荧光利用光源激发——光化荧光第七十二页，共90页。荧光显微镜的作用原理宽谱线发射光（汞灯）滤掉其他光，透过激发光激发滤色片吸收滤色片滤掉激发光，透过荧光标本受激发产生荧光向四周发散激发光受反射、折射或衍射向四周发散第七十三页，共90页。荧光的性质吸收光，必需有激发光源荧光波长＞激发波长（损失热能）荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率第七十四页，共90页。荧光显微镜的优点和用途优点：检出能力高（放大作用）对细胞的刺激小（可以活体染色）能进行多重染色用途：物体构造的观察——荧光素荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等发荧光量的测定对物质定性、定量分析第七十五页，共90页。荧光显微镜的主要部件

透射式吸收滤色镜暗场聚光镜激发滤色镜汞灯光源 落射式吸收滤色镜分光镜激发滤色镜汞灯光源第七十六页，共90页。落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜第七十七页，共90页。落射荧光显微镜的构造第七十八页，共90页。荧光显微镜光源

汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)

氙灯光源：高峰值更宽，更稳定第七十九页，共90页。荧光显微镜激发透镜组

激发滤色镜:激发波长选择

激发透镜组（激发块）:

T%nmBANDPASS入射光发射光激发滤色镜分光滤色镜吸收滤色镜第八十页，共90页。落射荧光显微镜各部件特性和作用吸收滤色镜:荧光透过,阻挡杂光分色镜:反射激发光,荧光透过＞A透过A＜A反射B＞B透过＜B阻挡nmnmT%T%A第八十一页，共90页。滤色镜的选择荧光素的特性滤色镜的特性激发分色吸收第八十二页，共90页。带宽对图象的影响SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:B