发酵种子的扩大培养

第四章种子的扩大培养种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备的技术概要第一页，共36页。种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻枯燥管中处休眠状态的消费菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。第一节种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念:第二页，共36页。种子扩培的目的

接种量的需要

菌种的驯化缩短发酵时间、保证消费程度种子的要求：

总量及浓度能满足要求

生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，可以迅速生长

无杂菌污染第三页，共36页。第一节种子制备过程举例一、谷氨酸消费的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵第四页，共36页。1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠

琼脂2%，培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过

3次第五页，共36页。2.一级种子〔摇瓶〕培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，

K2HPO40.1%，硫酸镁培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基一级种子质量要求种龄：12hpH值：6.4±0.1光密度：净增OD值以上残糖：％以下无菌检查：(-)噬菌体检查：(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反响第六页，共36页。3.二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养〔容积为发酵罐的1%〕，32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基通风量:50L种子罐1:0.5,搅拌转速340r／min；

250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r／min500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r／min第七页，共36页。种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列时完毕，活力旺盛无菌检查第八页，共36页。二、青霉素消费的种子制备制备过程安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵第九页，共36页。1、斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右第十页，共36页。2、大米孢子培养基：大米及氮源〔玉米浆〕培养基的特点：本钱低、米粒之间构造疏松进步比外表积和氧的传质，营养适当〔要求大米的白点小〕有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子第十一页，共36页。3、一级种子培养基：〔葡萄糖、乳糖、蔗糖〕、玉米浆目的：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨4、二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%第十二页，共36页。三、啤酒酵母的扩大培养三级扩大培养扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍第2级到第3级为4-6倍1，实验室扩大培养第十三页，共36页。2，车间扩大培养第十四页，共36页。从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种接种方式：从种子罐接种：第十五页，共36页。种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的才能最强第十六页，共36页。第二节种子制备的技术概要一、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。消费车间阶段：种子培养在种子罐里面进展，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为消费车间阶段。第十七页，共36页。二、实验室阶段1、培养物选择的原那么目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：

对于不产孢子和芽胞的微生物

——获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。第十八页，共36页。

获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因此更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。

对于产孢子的微生物

获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。第十九页，共36页。例：放线菌孢子的制备采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28˚C。培养时间为5~14天。第二十页，共36页。2，厌氧培养：对于酵母菌〔啤酒，葡萄酒，清酒等〕试管→三角瓶→卡式罐→种子罐对于产孢子才能不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。试管→三角瓶→摇床→种子罐第二十一页，共36页。2、培养基选择的原那么培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。第二十二页，共36页。3、起始接种物的传代问题

细菌保藏斜面→活化斜面

产孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少。第二十三页，共36页。

母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。

子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落②接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月孢子培养第二十四页，共36页。三、消费车间阶段1、培养物的选择原那么在消费车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。

缩短发酵时间

有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：第二十五页，共36页。2、培养基选择的原那么目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是根本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:

一是本钱二是驯化第二十六页，共36页。例：柠檬酸发酵

以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%第二十七页，共36页。

薯干粉成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%琼脂2%第二十八页，共36页。3、发酵级数确实定谷氨酸：三级发酵一级种子〔摇瓶〕→二级种子〔小罐〕→发酵青霉素：三级发酵一级种子〔小罐〕→二级种子〔中罐〕→发酵一般由菌丝体培养开场计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开场计算发酵级数第二十九页，共36页。发酵级数确定的根据

级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响

级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。在发酵产品的放大中，反响级数确实定是非常重要的一个方面第三十页，共36页。细菌：二级发酵茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐〔27˚C,40小时孢子发芽〕→二级种子罐〔27˚C,10~24小时〕→发酵罐放线菌：四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子常用微生物发酵级数：第三十一页，共36页。4、接种量确实定

移入种子的体积接种量＝—————————

接种后培养液的体积过大过小都不好，以理论定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。通常接种量：细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。第三十二页，共36页。5、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开场移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原那么：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。嗜碱性芽孢杆菌消费碱性蛋白酶，12小时最好。第三十三页，共36页。6、种子的质量要求：量：要求到达一定的浓度质:形态〔生长处于某个阶段、均匀等等〕理化指标：C、N、P的含量，pH，产物生成量