基因治疗医学PPT

基因治疗医学PPT基因疗法是指将外源正常基因导入靶细胞，通过替代异常基因、封闭致病基因、剪去致病基因、修复受损基因和重建基因调控系统等，以纠正或补偿因基因缺陷和异常所引起的疾病，从而达到治疗的目的

2021/4/272全世界已获准的基因治疗临床试验方案达一千多项，其中，66%是针对癌症的治疗

2021/4/273二、基因治疗的必要条件发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作2021/4/274三.基因治疗方式直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗(致病基因的原位置换)：纠正突变基因

在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2021/4/275基因敲出技术（geneknockout)是指通过基因同源重组的过程定向的在活细胞中从基因组上移出特定基因的过程，从而建立基因剔除细胞和基因剔除生物2021/4/276

2、间接基因治疗：

导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。直接抑制有害基因的表达2021/4/277基因增补：将目的基因导入病变细胞，并在细胞内表达，不需将缺陷基因替换出来，只要目的基因在细胞中能够表达，就达到了治疗的目的。这是目前基因治疗大多采用的方法，对单拷贝基因遗传病有效。如血友病。2021/4/278基因干预(geneinterference)：指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。基因干预2021/4/279基因干预的种类：反义RNA：封闭基因表达核酶：裂解特异的靶mRNARNA干涉技术：

2021/4/2710反义RNA(antisenseRNA):是指与mRNA互补的RNA分子,通常由15-20个核苷酸组成。这种反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合形成二聚体,从而阻止靶核酸的表达。两种机制:1.反义寡聚核苷酸可以激活RNaseH，该酶可以切割DNA·RNA杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解2.反义寡聚核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译2021/4/27112021/4/2712靶RNA上的结合位点必须是暴露的反义试剂必须被保护起来免遭核酸酶攻击必须保证反义试剂能够被细胞摄取并在胞内正确定位需克服技术问题:2021/4/27132001，2002连续两年被美国《Science》杂志评选为年度10大突破技术RNA干涉RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。2021/4/2714

2006年10月2日，现年47岁的AndrewZ.Fire和45岁的CraigC.Mello由于在基因沉默现象研究领域的杰出贡献而获得诺贝尔医学奖。

2021/4/2715RNA干涉机制:

外源dsRNA

进入细胞后可激活Dicer(多种核酸酶、解螺旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶）,可以切割双链RNA，双链RNA再与Dicer形成沉默复合物(RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干涉的过程。

2021/4/27162个步骤：（1）长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶(Dicer)切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA）（2）小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断2021/4/2717RNA干涉机制2021/4/27182021/4/27192021/4/2720目前RNA干扰技术主要应用于探查基因功能和探索治疗肿瘤或感染性疾病的可能性.初步的实验结果提示RNA干扰技术可用于治疗有异常基因的人肿瘤。用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。2021/4/2721将RNA干扰技术用于临床治疗人类疾病还有许多研究工作要做，如何将小干扰性RNA或能在细胞内生成小干扰性RNA样转录物的质粒DNA或病毒载体安全、有效地导入靶组织或靶细胞就是一个必须解决的问题。RNA干扰技术用于治疗人类疾病的安全性仍是个未知数。2021/4/2722四、基因治疗的基本程序

目的基因的选择与获得载体的选择将目的基因克隆到载体基因表达的检测治疗效果的体外研究建立动物模型治疗效果的体内研究药代及药理毒理研究中试研究申报及进行临床试验扩大规模进行试生产2021/4/2723(一)、目的基因的选择：你感兴趣的任何与疾病相关的基因2021/4/27241.能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因

肿瘤细胞主要有癌基因的突变、扩增、过度表达，对此可采用反义核酸或核酶；抑癌基因的突变、失活等，可采用野生型的正常基因作为治疗基因，用正常基因剔除或替换缺陷基因。

2021/4/27252.能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因

向肿瘤细胞转导参与细胞免疫的细胞因子（如IL-2、GM-CSF）基因，共刺激分子B7基因等，以增强宿主的抗癌免疫反应，可统称为免疫基因治疗。

2021/4/27263.肿瘤药物增敏基因

肿瘤药物敏感基因治疗是将编码某一敏感性因子的基因转入肿瘤细胞，使肿瘤细胞对某种原本无毒或低毒的药物产生特异的敏感性而死亡。这一表达敏感性因子的基因也被称为自杀基因.常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因

,该基因能将无细胞毒性的原药丙氧鸟苷（GCV）磷酸化，对细胞产生毒性作用2021/4/2727理想的治疗基因还必须：基因可有效导入靶细胞基因能在靶细胞中长期稳定存留导入基因能适量表达导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害2021/4/2728(二)基因载体的选择

有病毒载体有非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。2021/4/2729常用病毒载体的比较

逆转录病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体载体大小8.5kb36kb(大)5kb(小)核酸类型RNADNADNA外源基因容量＜7kb2～7kb＜3.5kb(小)靶细胞要求分裂细胞；

表面须有特殊受体分裂或非分裂细胞分裂或非分裂细胞基因整合随机整合不整合定点整合于19号染色体长臂外源基因表达情况瞬时表达/稳定表达瞬时表达稳定表达基因转染效率高高不明2021/4/2730(三)选择基因治疗的靶细胞体细胞：目前基因治疗的现状仅限于体细胞。基因型的改变只限于患者本人，不会遗传到下代。生殖细胞：理论上这是基因治疗的重点，对生殖细胞中缺陷基因的纠正，不仅使患者本人（当代）的缺陷得以更正，而且能将正常基因遗传到下代，是一种彻底根治缺陷的方法。但是由于风险大，问题复杂，至今仍未有人敢实验。2021/4/27311、发病的器官及位置2、容易取出和植入3、容易在体外培养4、容易被转导5、寿命较长基因治疗中体细胞的选择2021/4/2732免疫细胞

外周血淋巴细胞是恶性肿瘤、获得性及遗传性免疫系统紊乱性徉病的基因治疗的主要靶细胞。主要以T淋巴细胞为主成纤维细胞

成纤维细胞位于全身并具有较强的自我更新能力。优点有：①易于获得；②容易体外培养和扩增；③分裂中的成纤维细胞易与逆转录病毒一起稳定转导，并能较稳定的表达外源目的基因；④携带外源基因后能稳定地回植体内并进行表达；⑤回植的成纤维细胞容易取出，等。主要缺点是在体内由于细胞凋亡而引起的基因表达失活。2021/4/2733骨骼肌细胞

易于获得及在体个可大量扩增，可用于治疗累及肌肉的遗传病及一旦插入分泌性基因可使基因产物直接分泌进入血液等。

血管平滑肌细胞

血管平滑肌细胞易于获得、培养和移植，故是基因治疗常用的靶细胞。造血干细胞

造血干细胞是基因治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症常用的靶细胞。在肿瘤基因治疗中，造血干细胞是耐药基因、细胞因子基因等较理想的受体细胞。

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(四)基因转移

应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源目的基因（可以是基因的DNA片段或序列）转移到受体菌或者细胞内，并在细菌或细胞内实现转入基因的扩增和表达，称为基因转移技术。2021/4/27351、非病毒导入法：直接注射法、电穿孔法、脂质体法、阳离子多聚体2、病毒载体导入法2021/4/2736遗传病的基因治疗研究1990.9.14首例基因治疗4岁女孩严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)2--脱氧腺苷含量升高毒性严重破坏免疫功能ADA基因LN逆转录病毒载体靶细胞为病人淋巴细胞回输五、基因治疗的临床应用2021/4/2737腺苷脱氨酶缺乏症adenosinedeaminasedeficiency(ADA)2021/4/27382021/4/2739㈠修正肿瘤相关基因的功能纠正癌基因的表达恢复抑癌基因的功能㈡导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性自杀基因疗法HSV-tk

P53基因

肿瘤的基因治疗2021/4/27402021/4/2741六.基因治疗的问题与前景

基因治疗是一门新兴学科，研究历史较短，无论从技术上还是伦理学上都涉及到许多新概念、新问题和新挑战，其安全性一直以来都是争论最为激烈的问题之一，其治疗效果也还差强人意；但基因治疗有巨大的潜力和广阔的前景2021/4/2742在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，2000年时，宾州大学有病人在基因治疗中死亡，2002年在法国又发生先天免疫不全症bubbleboys基因治疗临床试验发生白血病的副作用。这两件失败的案例，皆被归因于病毒载体的不安全性.理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因,持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向。

2021/4/2743从理论上来说基因治疗是治疗癌症的最好办法，但由于其是新生事物，有些问题仍在探索之中，例如如何将病毒给到肿瘤的局部肿块部位，产生高浓度病毒攻击肿瘤细胞？每次要注入多少剂量的病毒？隔多长时间注入一次