一种药物注射剂类过敏反应高内涵检测方法的初步建立

一种药物注射剂类过敏反应高内涵检测方法的初步建立类过敏反应是药物注射剂最常见的不良反应，但现有检测方法尚存在诸多不足。该研究采用荧光标记和高内涵筛选技术建立了一种类过敏反应体外检测方法，应用RBL2H3细胞脱颗粒模型，以细胞膜特异荧光染料FM464标记细胞脱颗粒囊泡回收来确定阳性细胞数，以细胞核特异荧光染料Hochest3334标记细胞核来确定细胞总数，从而计算药物刺激后的细胞脱颗粒率。为了考察高内涵检测方法可靠性，首先采用阳性药物Compound48/80验证了高内涵检测方法与传统过敏介质卩氨基己糖苷酶释放和小鼠耳廓皮肤蓝染检测方法间一致性，结果显示高内涵检测方法与传统检测方法高度一致，且灵敏度高于传统检测方法；然后采用30批次临床报告过敏症状丹红注射液进一步验证高内涵检测方法的可靠性，结果提示高内涵检测结果与临床报告高度一致，而且高内涵方法一定程度上能够克服注射液自身颜色干扰问题。可见，类过敏反应高内涵检测方法是一种灵敏、可靠、简便且可实现高通量筛选的新方法，适用于药物注射剂类过敏反应评价，能够为临床安全用药提供指导。标签：类过敏反应；注射剂；高内涵；细胞脱颗粒[Abstract]Anaphylactoidreaction（AR）isthemostcommonadversereactionofinjectionformulations，however，thereareobviousdrawbacksinavailablemethodsforARdetectionAnovelinvitrodetectionmethodforARwasestablishedbasedonfluorescentlabelingandhighcontentscreen（HCS）systeminpresentstudyWiththeuseofRBL2H3cellsdegranulationmodel，positivecellcountwasdeterminedwithspecificcellularmembranefluorescentdyeFM464labelingvesiclerecycle，andtotalcellscountwasdeterminedwithspecificnucleusfluorescentdyeHochest3334，andthentheratioofcellsdegranulationafterdrugstimulationwascalculatedInordertoverifythereliabilityofthisHCSmethod， positivedrugCompound48/80wasfirstusedtoconfirmtheconsistenceofHCSmethodwiththetraditional^hexosaminidasereleasetestandtheEvansbluestainingearstestinmiceTheresultsshowedhighconsistencebetweenHCSmethodandtraditionaltestingmethods，andtheHCSmethodshowedhighersensitivitythantheothertwotestsThen30samplesofDanhonginjection（DHI）withclinicalallergysymptomsfurtherwereusedtoconfirmthereliabilityofthisHCSmethodTheHCSresultsshowedhighconsistencewiththeclinicalreport，andtheHCSmethodhadtheadvantageinreducingtheinterferencebydrugcolorTherefore，thisHCSmethodisreliable，sensitive，simpleandhighthroughputmethodindetectionofAR，applicablefortheARevaluationofinjectionformulations，andcanprovideguidanceforsafetyofclinicalapplicationinclinicalpractice[Keywords]anaphylactoidreaction；injection；highcontentsystem；celldegranulationdoi：10.4268/cjcmm20161024类过敏反应是药物注射剂最常见的不良反应。药物注射剂因绝对生物利用度高导致不良反应的风险性增高［1］，据报道临床类过敏反应占超敏反应的77%［2］，反映了类过敏反应发生的广泛性；中药注射剂引发的过敏性休克中有3/4属于类过敏反应［3］，反映了类过敏反应发生的严重性；因此，预测药物注射剂类过敏反应对指导临床安全用药非常必要。类过敏反应是机体首次接触类过敏原就会诱发肥大细胞/嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放过敏介质引起过敏症状，有别于过敏反应需经致敏阶段和IgE抗体介导，但两者在细胞脱颗粒引起过敏症状方面相同，在临床药物不良反应报道中常将两者混淆［46］。目前由于类过敏反应发生机制尚不清楚，缺乏特异性检测方法［45］，现有检测方法借鉴了过敏反应检测，包括在体和体外检测2类。在体检测方法采用动物直接给药，通过观测过敏症状、测定血清生化指标、评价血管通透性等方式判断类过敏反应发生［1，45，7］，优点在于接近临床反应状况，是目前预测药物类过敏反应的常用方法，不足之处在于动物用量大、症状评价主观性强、不同种属动物对同一药物反应差别大、费用高昂等。体外检测方法采用药物直接刺激细胞，通过检测释放的过敏介质、观测细胞脱颗粒形态改变、监测细胞脱颗粒过程等方式判断细胞脱颗粒的发生［78］。过敏介质测定多采用比色法，药物颜色对比色法测定干扰大，由于中药注射液多数具有颜色，因而限制了其应用；采用中性红、甲苯胺蓝和阿利新蓝等染料染色计算细胞脱颗粒率，由于染料特异性低导致检测结果准确率低；采用透射电镜观察脱颗粒细胞形态改变虽然准确率高，但实验成本高、操作复杂且不能动态观察，适用于研究机制但不适用于高通量筛选；采用标记囊泡特异蛋白方法，如AnnexinV［9］或CD63［10］，特异性高但实验程序操作复杂，不适用于高通量筛选，因此，有必要发展简单、快速、灵敏且特异的类过敏反应高通量监测方法来预测药物安全性。高内涵筛选(highcontentscreen，HCS)系统是基于荧光显微成像技术进行图像定量分析的自动化平台，能够在细胞结构和功能完整条件下检测药物对细胞多种功能活动的影响，本研究基于高内涵平台建立类过敏反应检测方法；细胞脱颗粒是类过敏反应的核心环节，包括囊泡转运、定向、锚定、融合和回收等步骤［11］，本研究采用RBL2H3细胞脱颗粒模型,应用膜特异荧光染料FM464标记细胞脱颗粒囊泡回收，在HCS系统检测药物注射剂所导致细胞内荧光强度增加来反映细胞脱颗粒状况，通过细胞核荧光染料Hochest33342标记细胞核进行细胞计数，计算细胞脱颗粒率来预测类过敏反应发生，从而建立一种预测注射剂类过敏发生的HCS检测方法。材料与方法试剂与仪器大鼠嗜碱粒性白血病细胞(RBL2H3)(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，CatNoTCR7)；MEM酚红(LotNo1645771)/无酚红(LotNo1663883)培养基，胎牛血清(LotNo1205330)(Gibco公司)；荧光染料FM464(LotNo1614994，Invitrogen公司)；荧光染料Hoechst33342(LotNo#4082，CellSingalingTechnology公司)；Compound48/80(LotNo014M4062V)，0氨基己糖(LotNoSLBL1919V)(Sigma公司)；伊文思蓝(LotNo619C047，北京索莱宝公司）；丹红注射液（国药准字Z20026866，荷泽步长制药有限公司）；高内涵Operetta及Harmony分析软件（PerkinElmer公司）；FlexStation3多功能酶标仪器（MolecularDevices公司）；48/96孔透明微孔板及96孔黑色微孔板（Corning公司）。12细胞培养及实验动物RBL2H3细胞，在37°C,5%CO2条件下用MEM完全培养基（89%MEM培养基，10%胎牛血清，1%双抗）培养，当细胞生长汇合度达到80%时按照1：5进行传代，约3d传代一次。ICR小鼠，SPF级，体重20〜22g，购自军事医学科学院，许可证号SCXK（军）20120004，饲养温度（25±2）C，相对湿度40%〜60%。本实验操作经由天津国际生物医药联合研究院动物福利伦理委员会批准实施（TJABJY2012001）。13建立类过敏反应HCS检测为了建立类过敏反应的HCS检测方法，采用Compound48/80作为工具药优化高内涵检测条件。131优化荧光染料FM464染色浓度和染色时间RBL2H3细胞接种于96孔黑色微孔板中培养24h，为了优化染色浓度，考察FM464在10,20,40,50mg・L-1染色效果；为了优化染色时间，FM464与细胞共孵育时间在15,30,45,60min时进行HCS检测。FM464激发波长520〜550nm,发射波长650〜760nm,在高内涵Operetta系统获得图像信息，采用Harmony分析软件进行图像分析。实验每次3个复孔，通过3次重复实验（n=9）确定，细胞实验设计除特殊强调外均与此相同。132优化Compound48/80的HCS检测浓度为了优化Compound48/80刺激细胞脱颗粒浓度，设立对照组、Compound48/80终浓度100,150,200,500mg・L-1组，在37C与细胞共孵育30min进行HCS检测。采用FM464特异染色囊泡膜回收来确定阳性细胞数，采用Hoechst33342特异染色细胞核确定细胞总数，Hoechst33342激发波长360〜400nm,发射波长410〜480nm,经HCS系统检测后计算细胞脱颗粒率。为了计算细胞脱颗粒率，首先根据文献结果［13］确定了对照组RBL2H3细胞基础细胞脱颗粒率40%,与对照组有显著性差异（图4）,在500mg.L-1时，HCS方法检测结果细胞脱颗粒率可达到〉90%；但在Compound48/80100mg・L-l卩氨基己糖苷酶释放率只有5%,与对照组无显著性差异（图5）,在500mg.L-1时只达到17%。这种现象可以从理论上得到解释，细胞脱颗粒可同时释放多种过敏介质，包括组胺、P氨基己糖苷酶、类胰蛋白酶等，因各种过敏介质本身释放量不同，加之测定方法灵敏度不同，导致检测单一过敏介质卩氨基己糖苷酶释放率有其局限性；与之相对应，所有细胞脱颗粒过程均存在囊泡回收现象，采用膜特异荧光染料标记囊泡回收现象，从理论上较检测单一过敏介质释放率灵敏度要高。在实际工作中，采用过敏介质释放评价类过敏反应常需要同时测定数种过敏介质，增加了工作量和试验成本；相比而言，囊泡回收是囊泡释放之后的关键步骤，采用特异细胞膜染色法较之中性红和甲苯胺蓝等染料的特异性强，因而可靠性和准确性更高。HCS检测方法与动物耳廓蓝染方法结论一致，证实了HCS方法的可靠性，由于两者剂量单位不同，无法比较两者间灵敏度高低，但显然基于细胞水平的HCS检测方法比动物耳廓蓝染方法在动物使用、操作便捷和高通量筛选方面具有显著优势。30批次临床报告过敏症状DHI样品HCS检测结果与临床观察结果符合率在866%，考虑到临床报告过敏症状样品的实际情况较复杂，其中可能包括了类过敏、过敏反应或药物毒性反应等情况，本实验结果属于与临床观察符合度较高水平。测试样品自身颜色是比色法测定的重要干扰因素，实验结果提示HCS方法抗干扰能力强于比色法。过敏介质测定多用比色法，包括组胺Elisa检测法、卩氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶检测法等，由于中药注射液多数具有颜色，会对试验结果存在严重干扰，本研究在测定临床报道过敏症状DHI样品对卩氨基己糖苷酶释放率影响时，确证了DHI自身颜色，尤其在稀释倍数低时对测试结果存在严重干扰，因此比色法在这种情况下的应用受到限制。HCS检测方法同样受到测试样品自身颜色干扰，在DHI样品测试中，本研究采用考察正常DHI样品对FM464荧光强度影响，计算出不同稀释倍数DHI降低FM464荧光强度转换系数，用于确定同等条件下脱颗粒细胞计数标准，从而获得类过敏反应样本在同样稀释倍数下的脱颗粒阳性细胞数，基于DHI初步实验结果提示荧光检测法比光谱吸收比色法在对抗测试样品自身颜色干扰能力强，提示HCS检测方法适用范围可能较比色法更广泛，同时考虑到中药注射液化学成分复杂，需要结合具体研究对象进行系统考察。总之，Compound48/80结果显示HCS方法结论与传统过敏介质检测方法卩氨基己糖苷酶释放率、整体动物耳廓蓝染反应结论高度一致，证明高内涵检测方法可靠；基于30批次临床报告过敏症状DHI样品检测结果证实HCS方法与临床观察结果高度一致，表明HCS方法能够用于预测药物临床类过敏反应。因此，本研究建立了一种简单、灵敏、高通量检测药物注射剂的类过敏反应高内涵检测方法。[参考文献]⑴李佳，黄芝瑛注射用辅料类过敏反应的非临床评价方法[J].药物评价研究，2010，33（1）：9.SzeheniJ.Complementactivationrelatedpseudoallergy：anewclassofdruginducedacuteimmunetoxicity[J].Toxicology， 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