专题2-课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

课题背景尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能干脆被农作物吸取。土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+2NH3CO2+H2O问：1尿素如何被利用的呢？2细菌为什么能分解尿素？土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分别出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中原委含有多少这样的细菌学习目标分解1.知道筛选目的菌株的思路和计数的方法，原理2.驾驭从土壤中分别分解尿素的微生物及进行平板计数的方法.一.探讨思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置比照1、实例：DNA多聚酶链式反应(PCR技术)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求运用耐高温（930C左右）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株提出的问题—如何找寻耐高温的酶？解决问题的思路—找寻耐高温环境启示：找寻目的菌种时要依据它对生存环境的要求，到相应的环境中去找寻。原理—高温淘汰其他菌种，选出耐高温菌种，耐高温菌种提取耐高温酶。阅读P21-23，思索：1、说出试验室中微生物的筛选原理2、依据本课题所运用的培育基，回答：①从物理性质看此培育基属于哪类？②该培育基的配方中，为微生物的生长供应碳源和氮源的分别是什么物质？③此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？3、总结统计菌落数目常用的方法，并据此分析P22（二）中两位同学的结果是否合理。4、分析P22（三）中A同学的试验，想想如何对其结果进行验证要分别一种微生物，必需依据该微生物的特点，包括养分、生理、生长条件等，配置合适的培育基。方法：⑴抑制大多数微生物生长⑵造成有利于该菌生长的环境结果：培育确定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板法等方法对它进行纯化培育分别。2、试验室中微生物的筛选原理：人为供应有利于目的菌株生长的条件(包括养分、温度、pH等)，同时抑制或阻挡其他微生物生长。选择培育基15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、本课题所运用的培育基：①从物理性质看此培育基属于哪类？固体培育基②该培育基的配方中，为微生物的生长供应碳源和氮源的分别是什么物质？③此培育基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？碳源：葡萄糖氮源：尿素能。该培育基的唯一氮源为尿素，只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。试验组比照组培育基类型是否接种

目的

结果以尿素为唯一氮源的培育基牛肉膏蛋白胨培育基

是是分别分解尿素的细菌推断该培育基有无选择性只生长分解尿素的细菌生长多种微生物怎样证明此培育基具有选择性呢？1、显微镜干脆计数：可以利用血球计数板，在显微镜下计算确定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；个体小的细菌在显微镜下难以视察缺点2.间接计数法（活菌计数法）（1）常用方法：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培育基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推想出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法思索：活菌计数法统计的菌落数是否与活菌实际数目吻合？为什么？统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上视察到的只有一个菌落因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培育基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的做法正确吗？假如有问题，错在哪？甲：没有重复试验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值注：误差太大，须重做或再多设几组?留意事项①为了保证结果精确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值将同一稀释度至少涂布三个平板作重复组，培育计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数来表示。⑤每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。利用选择培育基进行尿素分解菌的分别过程中，从对应稀释倍数为106的培育基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培育基被杂菌污染了，或培育基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培育基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。

?缘由：⑴土样不同⑵培育基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，试验结果要有劝服力，比照组的设置是必不行少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行试验方案二：将A同学配制的培育基在不加土样的状况下进行培育，作为空白比照，以证明培育基是否受到污染。结果预料：a.假如结果与A同学一样，则证明A无误；b.假如结果不同，则证明A同学存在操作失误或培育基的配制有问题。设置比照的主要目的是解除试验组中非测试因素对试验结果的影响，提高试验结果的可信度。㈢.设置比照：限制变量设置比照的方法：空白比照：不给比照组任何处理因素。条件比照：给比照组施以部分试验因素，但不是所要探讨的处理因素。自身比照：比照组和试验组都在同一探讨对象上进行。相互比照：不单设比照组，而是几个试验组相互比照。练习：推断正误：1、依据培育皿中菌落数可以精确计算样品中含有的活菌实际数目（）2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素（）3、筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培育基中的唯一氮源（）4、统计样品中的活菌一般用平板划线法（）×√×√【巩固1】分别土壤中分解尿素的细菌，对培育基的要求是()。①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐A．①③⑤⑦B．②④⑥⑧C．①③⑤⑧D．①④⑥⑦【巩固2】用来推断选择培育基是否起到了选择作用，须要设置的比照是()。 A.未接种的选择培育基 B.未接种的牛肉膏蛋白胨培育基 C.接种了的牛肉膏蛋白胨培育基 D.接种了的选择培育基CC阅读P23-26，思索：1、说出土壤取样的缘由和操作方法2、说出样品稀释的目的，熟记细菌、放线菌、真菌的稀释倍数3、熟记细菌、放线菌、霉菌的培育温度和时间4、说明鉴定该种细菌能够分解尿素的方法二、试验设计：土壤取样制备培养基样品稀释取样涂布平板微生物培养、观察菌落计数二.试验设计㈠.土壤取样同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。◆取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在运用前都要灭菌。P25㈡.制备培育基：制备以尿素为唯一氮源的选择培育基。（三）样品的稀释◆应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。P25

◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。◆在实际操作中，通常选用确定稀释范围的样品液进行培育。以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106放线菌稀释度为103、104、105真菌稀释度为102、103、104为什么分别不同的微生物要接受不同的稀释度？缘由：土壤中各类微生物的数量是不同的。结论：为获得不同类型的微生物，就须要按不同的稀释度进行分别，同时还应当有针对性地供应选择培育的条件。测定土壤中细菌的数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培育，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释。其缘由是（）A.细菌个体小，真菌个体大B.细菌易稀释，真菌不易稀释C.细菌在土壤中的数量比真菌多D.随机的，没有缘由C◆试验时要对培育皿作好标记。注明培育基类型、培育时间、稀释度、培育物等。㈣.取样涂布㈤.微生物的培育与视察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培育时间不足而导致遗漏菌落的数目。不同种类的微生物，往往须要不同的培育温度和培育时间：细菌：30～37℃培育1～2d放线菌：25～28℃培育5～7d霉菌：25～28℃培育3～4d一般来说，在确定的培育条件下（相同的培育基、温度及培育时间），同种我微生物表现出稳定的菌落特征。包括菌落的形态、大小、隆起程度和颜色等方面。菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。微生物的培育与视察〖思索〗在探讨未知微生物时务必规范操作，以防被感染，试验后确定要洗手。致病微生物三、操作提示P251、无菌操作2、做好标记3、制定支配◆为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先制定支配。四.结果分析与评价(一）培育物中是否有杂菌污染以及选择培育基是否筛选出菌落通过比照试验，若培育物有杂菌污染，比照的培育基菌落数偏高；若培牛肉膏蛋白胨培育基的菌落数远大于选择培育基的数目，说明选择培育基已筛选出一些菌落。（二）样品的稀释操作是否成功及重复组的结果是否一样提示：假如得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，假犹如一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，须要重新试验。五.课外延长在以尿素为唯一氮源的培育基中加入酚红指示剂。培育某种细菌后，假如PH上升，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法-滤膜法。是将确定体积的水过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培育基上培育，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计数得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

本课题学问小结:1．下列是关于“检测土壤中细菌总数”试验操作的叙述，其中错误的是（）A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培育基，经高温、高压灭菌后倒平板B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上C．将试验组和比照组平板倒置，37℃恒温培育24～48hD．确定比照组无菌后，选择菌落数在300以上的试验组平板进行计数实践训练D

2.推断：利用稀释涂布平板法既能分别微生物也能对微生物进行计数接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落以尿素为唯一氮源且含酚红的培育基可选择和鉴别尿素分解菌√√√3．尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌），培育基成分如表所示，试验步骤如图所示，请分析回答问题：（1）培育基中加入尿素的目的是筛选到________，这种培育基从功能上属于____培育基。（2）“目的菌”生长所需的氮源来自培育基中的___________，其同化作用类型是______________。目的菌选择异养型尿素15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到100mL（3）下图是接受纯化微生物培育的两种接种方法接种后培育的效果图。则获得图A效果的接种方法是____________，图B效果的接种方法是___________，一同学在纯化土壤中的细菌时，发觉培育基上的菌落连成一片，最可能的缘由是__________________（答出一条即可）。稀释涂布平板法平板划线法菌液浓度过高（4）在进行分别分解尿素的细菌试验时，某同学从培育基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落，该同学的试验结果产生的缘由可能有______（填序号）①由于土样不同②由于培育基污染③由于操作失误④没有设置比照①②③4.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸取利用，还影响对其他养分物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸取利用的磷酸盐等。以下是科研人员从作物根部土壤中分别产植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答。(1)培育基中除了添加植酸钙以外，应含有__________、__________、水、无机盐等基本养分物质。碳源氮源(2)分别产植酸酶的菌株，需先配制合适的培育基，配制培育基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是_________和灭菌。对培育基进行灭菌的常用方法是____________。通常每种稀释液需涂布___个平板，取其平均值。若将最终一个试管中的菌液每次吸取0.1mL涂布培育后获得平均值是C，则1g土壤中含有此菌的菌株数是_______个。调整pH值高压蒸汽灭菌3C×106(3)为防止杂菌污染，要对培育基和培育皿等进行_______________，而且须将接种后的培育皿呈__________状态放置。(4)接种以前进行的一系列操作，目的是在培育皿表面形成__________。依据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的__________就能大致推想出样品中的活菌数。灭菌倒置单个菌落菌落数5．微生物与人类关系亲密。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的，请回答下列有关问题：(1)下表为两种微生物的培育基配方。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB培育基：纤维素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5gA培育基：将上述两种培育基中的物质分别溶解后，均用蒸馏水定容到1000mL。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB培育基：纤维素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5gA培育基：(1)①假如要进行土壤中分解尿素的细菌的分别，则须要选择上述哪种培育基？________，该培育基能分别尿素分解菌的缘由是：②在该培育基中可加入________指示剂，依据指示剂的颜色可鉴定该种细菌能够分解尿素。③从功能上来看，上述两种培育基均属于________培育基。A培育基培育基中尿素为唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生长繁殖酚红选择(2)把牛肉膏蛋白胨固体培育基倒入平板，等培育基冷凝后，应将平板________放置，这样做的目的是可防止________________________造成污染。(3)微生物接种的方法很多，平板划线法操作结束时，为什么仍须要灼烧接种环？____________________________________。(4)微生物培育过程中还有什么方法或步骤要防止其他微生物污染？________________、_______________________、________________。KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB培育基：纤维素粉NaNO3Na2HPO4·7H2OKH2PO4MgSO4·7H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5gA培育基：倒过来皿盖上的水珠落入培育基杀死接种环上残留菌种，避开污染环境和感染操作者培育基灭菌接种环境灭菌接种过程无菌操作6.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下试验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培育基成分如下表所示，试验步骤如图所示。请分析回答问题：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10g尿素1g琼脂15g将上述物质溶解后，用自来水定容到1000mL(1)培育基中加入尿素的目的是_____________，这种培育基属于________培育基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培育基中的________和________，试验须要振荡培育，缘由是________________________。(3)在以尿素为唯一氮源的培育基中加入___________，细菌合成的_