第13章基因课件

第十三章

基因工程和分子生物学常用技术GeneticEngineeringand

ThePopularTechnologyInMolecularBiology第1节基因工程与基因重组GeneticEngineeringandrecombination一、基因工程的概念基因工程是将各种来源（内、外）的原核、真核、天然或人工方法获得目的基因，在体外与载体基因重组后，导入适当的宿主细胞，DNA重组体随着细胞增殖而扩增，再通过基因表达得到大量目的基因片段（分子克隆，clone）的技术。基因工程技术是把不同来源的目的基因和载体DNA分子重新组合，故亦称为重组DNA技术。基因工程四要素1.目的基因2.工具酶3.载体4.受体细胞重要的工具酶

（1）限制性核酸内切酶（Restrictionendonuclease）发现：

1968年，沃纳·阿尔伯博士在研究噬菌体的遗传现象时碰到一个奇怪的现象，当新的大肠菌感染了噬菌体时，有的噬菌体开始繁殖，有的却根本不繁殖。他决定先研究这种“限制性噬菌体感染现象”，第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，为此获1978年诺贝尔生理学医学奖。限制酶能在DNA上寻找特定的切点，将DNA分子的双链交错地切断。因此限制性内切酶又称为“分子剪刀”，可以完整地切下个别基因。目前人们已经分离提取了400多种“分子剪刀”，可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割。

沃纳·阿尔伯博士1.限制性核酸内切酶概念、特点识别DNA的特异序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸水解酶。是基因工程“分子刀”。特点：*切割DNA多聚核苷酸链中磷酸二酯键*具有回文结构特征5′•••GAATTC•••3′3′•••CTTAAG•••5′2.限制性核酸内切酶识别序列与切割产物限制性核酸内切酶识别序列及切割位点切割产物形成末端EcoRⅠ3’黏性末端PstⅠ5’黏性末端NruⅠ平末端5’…G↓AATTC…3’5’…GAATTC…3’3’…CTTAA↑G…5’3’…CTTAAG…5’5’…CTGCA↓G…3’5’…CTGGAG…3’3’…G↑ACGTC…5’3’…GACGTC…5’5’…AG↓CT…3’5’…AGCT…3’3’…TC↑GA…5’3’…TCGA…5’注：具有黏性末端的DNA分子更容易结合进载体DNA分子中。（2）DNA聚合酶（DNApolymerase）以DNA为模板，dNTP为原料，RNA作引物，从引物的3’-末端或切口3’-末端沿5’→3’方向延长核苷酸链。该酶具有3’→5’或5’→3’核酸外切酶活性。基因工程主要应用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。（3）DNA连接酶（DNAligase）

1976年，科学家在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接来，修复好DNA链的断裂口。这种酶叫作DNA连接酶，是名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种

DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。慢病毒环绕双链DNA的DNA连接酶（彩色部分）载体

能够携带外源DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。其化学本质是DNA。易进入宿主细胞，并能在体内繁殖。具有多克隆位点，易插入外源基因。有可供选择的遗传标记，能够进行筛选。易从宿主细胞中分离纯化。

常用载体：质粒、噬菌体、黏粒、病毒。理想载体的选择标准1.质粒(plasmid)基因工程中最常见的载体。是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的环状双链DNA。通常质粒的大小为2～300kb。一般只能容纳10kb的外源DNA片断。外源DNA片断越长，越难插入和稳定。2.噬菌体(bacteriophage，phage)寄生于细菌体内，并能溶解细菌细胞。具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。λ噬菌体两种生长途径（示意图）3.黏粒(cosmid)黏粒是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。黏粒本身约4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。4.病毒病毒载体更多地用于真核表达系统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。重组DNA技术的原理和工程DNA重组包括下列五个过程。1.制备目的基因2.目的基因与载体的连接3.将外源DNA或重组体导入受体细胞。4.目的基因的筛选和鉴定。5.克隆基因的表达。 1.目的基因的制备1）制备基因组DNA文库

使用相同载体的一组基因的克隆。所有被克隆的DNA分子能表示整个生物的基因组。

有质粒文库、黏粒文库、噬菌体文库、酵母人造染色体文库。2）制备cDNA文库（3）聚合酶链反应(PCR)在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因。（4）化学合成基因2、目的基因与载体的连接——基因工程的核心（主要有以下4种连接方式）1)粘性末端连接2）平头末端连接3）人工接头法4）同源多聚尾连接法3、重组DNA导入宿主细胞转化：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；感染：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程4.重组DNA的筛选与鉴定：遗传学、免疫学、分子杂交等5.克隆基因的表达基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。基因工程的主要步骤二、基因诊断和基因治疗（一）基因诊断（DNAdiagnosis）基因诊断是采用分子生物学的技术方法直接检测与分析基因的结构（DNA）及其表达水平（RNA）是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。

1.基因诊断特点：特异性强灵敏度高（选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术）诊断范围广（可检测正在生长的病原体或潜在病原体）。能对疾病早期进行诊断直接对表型疾病作出诊断，还可能发现潜在的致病因素，如:确定有遗传病家族史的人携带致病基因。2.基因诊断的应用1）病原微生物的侵入：病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫。当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。2）先天性遗传疾病：遗传性疾病。发病原因为特定基因突变。3）恶性肿瘤研究：个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3.基因诊断的基本原理与方法

基因诊断的原理：用已知的核苷酸序列测定未知的核苷酸序列。基因诊断主要方法：核酸分子杂交、PCR技术、DNA序列测定、几种技术手段联合应用等α-地中海型贫血症（病例）

一对夫妻第一胎生一男孩，经诊断为重型α-地中海型贫血症，即HbHart’s胎儿水肿综合症。为常染色体隐性遗传病。妻子又怀孕，夫妻想知道胎儿是否正常发育，欲做产前诊断。专家运用限制性内切酶BamHI和BglⅡ分别酶切孕妇的外周血和胎儿绒毛组织DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离后，进行Southern印迹转移后，再用32P标记的α-珠蛋白基因探针进行杂交。分析所得酶谱，检测结果该胎儿为α-地中海贫血。（二）基因治疗（genetherapuy)狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，是对缺陷的基因进行修复、矫正，或以正常功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。治疗途径属于体外（exvivo）基因治疗。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达，从而达到治疗或预防疾病的新措施。治病途径属于体内（invivo）基因治疗。

基因治疗总策略1.直接补替缺陷基因；2.抑制非正常基因产物表达；3.间接调节机体本身免疫系统的抗病能力；4.利用外源基因对病变细胞造成特异性杀伤。

基因治疗方法：①基因矫正（genecorrection）：即对缺陷基因的异常序列进行精确原位修复。②基因置换（genereplacement）：以正常功能基因原位置换异常基因，不涉及基因组的任何改变。③基因增补（geneaugmentation）：不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。④基因失活（geneinactivation）：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的活性表达。基因疗法最重要的问题：理想载体的选择

安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用。

基因工程技术在分子医学上的应用：①发现疾病基因。确定克隆基因在分子遗传病中的作用。②发展生物制药。利用重组DNA技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品。己经或正投入市场的基因工程产品有胰岛素、生长素、促红细胞生成素等。③基因诊断。④基因治疗。⑤遗传病的防治。利用基因工程技术可进行产前诊断、携带者测试、症候前诊断、遗传病易感性诊断等。第2节分子生物学常用技术

（一）概念用已知碱基的核酸序列作探针，检测待测样品中是否存在与探针互补的同源核苷酸序列的方法。

一、核酸分子杂交技术（nucleicacidhybridization）分子杂交的双方：1、特异标记的探针。2、待测的核苷酸序列。核酸探针的概念：是指用放射性核素、生物素等活性物质标记的，能与特定核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。理想探针的选择方案①必须为单链结构；②高度特异性，只与靶核苷酸序列杂交；③高度灵敏性；④标记物与探针结合后，决不能影响其碱基配对，及探针分子的理化性质；⑤一般探针越长，杂交作用越强，专一性越强。但小片段探针杂交速率快。⑥环境污染小，价格低。探针种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、及人工合成的寡核苷酸探针等。（二）核酸分子杂交方法DNA印迹杂交（Southernblot）RNA印迹杂交（Northernblot）斑点及狭缝印迹杂交（Dot-blot）原位杂交(situhybridization)1.Souhern印迹杂交将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固相支持物上，再用标记的DNA探针检测待测DNA的方法。主要检测经凝胶电泳分离并转移到膜上的DNA分子。Southern印迹杂交的基本过程：①待测核酸样品的制备；②待测DNA样品的电泳分离；③凝胶中核酸的变性（碱变性)；④Southern印迹Southern印迹法可用于克隆基因的酶切图谱分析，检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等，在分子克隆、遗传病诊断、肿瘤研究、器官移植等方面发挥作用。

1975年,Southern印迹杂交（Southernblot）由英国人埃德温·迈勒·萨瑟（EdwinMellorSouthern）创建。

Southern印迹杂交显色图片2.Northern印迹杂交

原理

Northern印记杂交亦称为Northernblot，用于鉴别RNA的杂交。杂交的受体是RNA，探针可用DNA或RNA片段。其基本原理是将待测的RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行固-液相杂交。3.斑点及狭缝印迹杂交

斑点杂交直接将变性的DNA或RNA样品点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上使之成为斑点，再与探针进行杂交。斑点印迹为圆形，狭缝印迹为线状。4.原位杂交（insituhybridization）

核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交的方法。二、聚合酶链反应（PCR)（一）概念聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR），又称无细胞克隆技术(freebacteriacloningtechnique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的技术。通过PCR技术，可以简便快速地从微量生物材料中，以体外扩增的方式获得大量特定的核酸序列。（二）PCR的工作原理

PCR是体外酶促反应，依据DNA复制为理论基础。PCR反应体系：1.耐热DNA聚合酶

（taqDNA聚合酶）常用从嗜热水生菌分离出来的taqDNA聚合酶，在95℃高温下依然有活性，最适温度为70℃～80℃，不会在热变性中失活，具有5’→3’聚合酶活性，5’→3’外切酶活性。2.DNA模板

微量待扩增的DNA片段，由组织细胞提取、mRNA反转录及人工合成。3.寡聚核苷酸引物根据被扩增的DNA两侧序列而人工合成，通常为20个碱基对左右。4.dNTP原料。即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，PCR操作时，4种dNTP必须以等摩尔配制，以降低出错机率。5.含Mg2+的缓冲液

Mg2+是DNA聚合酶活性所必须的激活剂。PCR的基本步骤：1.高温变性

高温95℃，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板。变性时间30s。2.低温退火

将反应液温度迅速降至低温（37～55℃），两条人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板链互补结合，形成部分双链。退火时间30s。3.适温延伸在最适温度（72℃）下，TaqDNA聚合酶以引物3’-OH末端为合成的起点，催化4种dNTP沿模板5’→3’方向合成DNA新链。延伸时间约1.5min。所合成的DNA片段又可作为下一轮热变性的模板。经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。聚合酶链反应的基本步骤PCR技术具有简单快捷、高度灵敏性和特异性，在病原体检测与治疗、遗传及优生优育、肿瘤基因检测、免疫检测、司法鉴定等领域有重要应用。三、DNA芯片技术

DNA芯片（DNAchip）技术隶属于生物芯片技术。DNA芯片通过微加工技术，将数以百万计特定序列的DNA片段（基因探针）有规律地排列，固定于2cm2的硅片、玻片等固相支