分子诊断领域的新技术和新产品

分子诊断领域的新技术和新产品

HRM概述什么是DNA的高分辨率熔解DNA高分辨率熔解的用途HRM技术优势小结HRM介绍基于熔解曲线的一种DNA分析技术分辨率可达单个碱基用于突变扫描、SNP分型等研究高通量、快速、低成本、操作简单、闭管操作的新技术HRM概述概述什么是DNA的高分辨率熔解DNA高分辨率熔解的用途HRM技术优势小结SYBRGREENI对PCR扩增有抑制因此必需使用低浓度的染料SYBR®GreenI一些染料在熔解开始后可以重新定位非饱和态结合允许染料在熔解过程中发生重新定位，因而无法适用于HRMSYBRGREENI：非饱和染料用于HRM的新染料：SYTO9,EvaGreen,LCGreen等EvaGreen染料饱和后使其在熔解过程中没有空位进行重组饱和染料抑制低高浓度可以使DNA达到饱和降低了染料位置重组的可能饱和染料检测不受位点局限，既可针对已知位点，又可扫描未知位点无需序列特异性探针，检测成本低操作简便，PCR之后直接进行HRM分析真正实现闭管操作，PCR产物无需转入其它分析装置，直接在PCR管内分析快速、高通量、低成本，仅在普通PCR基础上增加一个染料高分辨率熔解曲线特点概述什么是DNA的高分辨率熔解DNA高分辨率熔解的用途HRM技术优势小结SNP基因分型/等位基因区分突变发现/筛查/扫描物种鉴定HLA兼容性检测胞嘧啶甲基化HRM的应用-举例C12345678M病人8(GG)病人5(AA)病人1(AG)SNP基因分型/等位基因区分——基因分析SNPs在野生型DNA物种的背景下检测出突变-灵敏度5%野生型发现未知突变189bp产物37%GC含量突变发现/筛查/扫描——

突变发现（体细胞突变）PeterMacCallumCancerCentreMelbourne野生型病人1335G->T病人2235G->T病人634G->T病人1838G->A差异视图：突变检测M.FlavescensM.AviumComplex2M.Avium26M.UlceransM.KanassiM.Tuberculosis生成自动分型报告物种鉴定——分支杆菌种属鉴定金黄色葡萄球菌分型High-ResolutionMeltingAnalysisofthespaRepeatRegionofStaphylococcusaureus.ClinicalChemistry,54:2(2008)结论：“AnalysisofthespalocusbyHRMresolvesspasequencevariants.Thissingle-andclosed-tubesingle-stepmethodforS.aureusgenotypingcanbeeasilycombinedwiththeinterrogationofothergeneticmarkers.”20种HRM曲线重复性（灰色/黑色）2种不同基因型３组相似spa区比较20个探针SS测序母方的阿姨1病人父方阿姨母方阿姨1104关系GenericPCR-2天

X

X110404011143040311

042天病人母方阿姨12.5小时不匹配04010403HLA兼容性分析：姐姐07,13另2个哥哥07,13病人1303,1601哥哥1303,1601070113031601HLA兼容性分析：检测胞嘧啶甲基化——MGMTHRM数据100%甲基化的50%甲基化的25%甲基化的12.5甲基化的3%甲基化的6%甲基化的未甲基化的Methylation-sensitivehighresolutionmelting(MS-HRM):anewapproachforsensitiveandhigh-throughputassessmentofmethylation,NucleicAcidsResearch,2007,35(6):e41检测胞嘧啶甲基化——MGMT差异视图100%甲基化的50%甲基化的25%甲基化的12.5%甲基化的6%甲基化的3%甲基化的温度均一性（各样本孔位温度差异）——0.2℃以下温度分辨率，即最小的升温幅度——0.05℃以下快速的温度平衡

精确、高效能的光源

温度准确性HRM对PCR仪的要求温度均一性（各样本孔位温度差异）——0.2℃以下RGQ——+0.01℃温度分辨率，即最小的升温幅度——0.05℃以下RGQ——0.02℃快速的温度平衡RGQ——流动空气精确、高效能的光源

RGQ——LED温度准确性RGQ——+0.25℃凯杰RGQ对于HRM的响应什么是PCR仪的温度均一性？温度均一性会影响什么？温度均一性就是仪器各孔位升降时温度的一致性，温度的一致性直接影响PCR的扩增效率温度均一性直接决定定量结果的准确性和重复性定量PCR实验一般都要40个循环，温度的微小差异都会同步无限放大，影响结果的准确性和重复性扩增效率对结果的影响：国外权威文献对PCR仪的温度均一性的比较文献标题：ExpandedInstrumentComparisonofAmpliconDNAMeltingAnalysisforMutationScanningandGenotyping.（PCR扩增仪器在DNA突变扫描及分型方面的比较）ClinicalChemistry53,No.8,2007（临床化学杂志，2007）注：临床化学杂志（美国）是当今临床实验室领域最主要和最权威的期刊，除了被引用次数最多之外，还拥有最高的化学（包括生物化学）影响因子。内容摘要：Results:Theabilityofmostinstrumentstoaccuratelygenotypesingle-basechangesbyampliconmeltingwaslimitedbyspatialtemperaturevariationacrosstheplate(SDofTm0.020to0.264°C).Othervariablessuchasdatadensity,signal-to-noiseratio,andmeltingratealsoaffectedheterozygotescanning.大多数仪器由于板式加热的板内温度差异的问题限制了其通过熔解曲线分析单碱基差异的准确性。

air-basedinstrumentsandinstrumentswithindividualsampletemperaturecontrolhavelowerTmSDs(0.018–0.065)thantheirheat-blockcounterparts(0.092–0.274).BlocksystemswiththermalelectricheatershadlowerTmSDs(0.092–0.102)thenPeltier-basedsystems(0.117–0.274).基于空气加热的仪器的孔间温度差异最小(0.018–0.065度)

Therefore,genotypingbyTm(determinedasthetemperatureat50%ofthenormalizedfluorescence)isstraightforwardandhasanaccuracydirectlycorrelatedtotemperaturehomogeneity.

因此由熔解曲线分析基因型的方法简单直接，其准确性直接与温度均一性（孔间温度差异）相关。常规孔板式PCR仪的温度均一性（精确性）96孔板内温度差异±0.50℃（或更高）

(由此，>1.00℃的差异很常见)边缘和四角的样品所受的影响最显著注意：荧光强度

1/Temp半导体模块易损坏/耗，而出现“热点”Rotor-Gene不使用半导体，因为半导体的损坏很难预测，且维修昂贵注意：Rotor-GeneQ的参数：均一性：±0.01℃，分辨率：±0.02℃冷空气吸入离心风扇将空气吸入仓内离心风扇促进空气在仓内循环仓盖打开以排出热空气降温原理加热元件关闭注意：转子中间的孔是为了空气均一流动设计的Rotor-GeneQ的升降温方式——空气加热，离心式孔板式加热与空气加热的比较孔板式加热空气加热Thermalunit孔板式典型光学系统中心强度高于边缘，需要加入ROX内参照来校正光强度顶部光路激发：光强度不一致问题离心式光学部分的3D动画LEDlightsource(rotatesforeachchannel)rotorspinstubesat400rpmlensfilterset(rotatesforeachchannel)sensitivePMT(photomultiplier)detectorRotor-GeneQ的光路结构400rpm匀速离心，各样品温度完全一致，扩增效率均一温度均一性：±0.01℃温度均一性升降温速度：最大速率>10℃/秒温度分辨率：±0.02℃平衡时间：无需无需光路系统校正，无需ROX校正染料高度稳定的LED光源终身质保，没有昂贵的光源需要更换，没有光强缓慢的衰减Rotor-GeneQ的温度、光学表现真正胜任高分辨熔解曲线，即使是第四类SNPSanger测序：经典方法，基于末端终止法的毛细管电泳新一代测序：基于合成的实时测序焦磷酸测序（凯杰）：定量测序，短片段，针对临床设计，灵活/快速/简单/经济，另有EGFR/KRAS/BRAF等成品试剂盒454测序：基因组全长测序，上千万个碱基测序Illumna：基因组全长测序，上千万个碱基测序SOLID：基因组全长测序，上千万个碱基测序测序技术及平台简介新一代

基因定量测序系统

－焦磷酸测序

焦磷酸测序的特点新一代测序技术：基于实时合成技术的测序方式高精度定量分析：测序的同时，能够得到基因突变比例的定量数据，定量精度达到1％～5％简单快捷：专门针对临床设计的短片段测序，整个实验流程只有三步4小时内完成（24个样本），96个样本测序只需要5～6小时，当天下午就能够出诊断结果灵活：通量灵活（样本数量随意，无需积攒样本）应用种类灵活（一次实验可以做多种测序）可以使用凯杰的成品检测试剂；也可以自己研发试剂，只要针对分析的序列，设计相应的引物，轻松实现转化医学经济：无需昂贵的开机试剂费用，成本与样本数量一致自己研发的试剂，只需要较低的基础运行成本

焦磷酸测序原理焦磷酸测序流程焦磷酸测序的应用及举例焦磷酸测序设备小结焦磷酸测序技术介绍第一步：加入测序引物和试剂第二步:每次加入一种dNTP，如果结合，则产生一个焦磷酸（PPi）第三步：硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比)第四步：多余的dNTP被降解，开始新一个循环主要特点：基于实时测序技术的检测和定量lighttime

焦磷酸测序原理焦磷酸测序流程焦磷酸测序的应用及举例焦磷酸测序设备小结检测设计

测序样本准备

Pyro测序1~2h~30min~10min

PCR扩增Regionofinterestisamplifiedwithtwoprimers–oneprimermustbebiotinylated.(~100-300bp)重要的部分是两条引物的扩增－一条引物必须很小usingstreptavidin-coatedbeads.分离成单链DNAAnnealingofsequencingprimer.测序引物退火

Sequencing-by-synthesis.Sequencedatageneratedfromthefirstbasenexttothesequencingprimer.基于合成的测序。第一个测得的碱基是紧挨着测序引物的。Sequencecontextasbuiltincontrol

PyroMarkAssayDesignSoftware2.0–设计PCR和Pyro引物最简单和可靠的方法焦磷酸测序流程PCR试样预处理，获得单链模板测序10min/24sampleSQA:35min/24sampleSNP:10min/24sample1-2h/96sample实验设计结果分析焦磷酸测序流程

焦磷酸测序原理焦磷酸测序流程焦磷酸测序的应用及举例焦磷酸测序设备小结Pyrosequencing（焦磷酸测序）

三种焦磷酸测序的应用

基因检测：个性化治疗，靶向治疗表观遗传学微生物为什么要个体化医疗？－－药物并非人人有效QuelleBrianB.Spear,MargoHeath-Chiozzi,JeffreyHuff,“ClinicalTrendsinMolecularMedicine,Volume7,Issue5,1May2001,Pages201-204抗抑郁药哮喘药糖尿病关节炎老年性痴呆肿瘤62%60%57%50%30%25%药物效果=无效对A是特效药，对B可能不是所有服用易瑞沙、特罗凯的患者必须检测EGFR基因！！所有晚期非小细胞肺癌患者，都有检测EGFR基因的指证。EGFR突变的预测作用已明确，携带这些突变基因的患者对吉非替尼（易瑞沙）或厄洛替尼（特罗凯）的反应明显较佳。国内外大型临床试验研究（如IPASS、SLCG等）均已证明，吉非替尼或厄洛替尼用于晚期肺癌EGFR突变型患者，可明显使其病灶缩小，生存期延长，还可用于一线治疗降低死亡风险率。结直肠癌患者使用靶向药物（爱比妥）等必须做KRAS基因检测！

2008年6月,在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上CRYSTAL、OPUS等研究表明KRAS基因状态与表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂疗效之间的关系逐渐明朗；10月,KRAS基因检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。

新指南传递给广大医师和患者这样两条重要的信息,一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态,二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗(包括单药或与化疗联合)治疗。

KRAS基因是野生型还是突变型,使传统意义上的一种疾病被分成两种独立的疾病。KRAS突变型结直肠癌患者约占40%,这类患者不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用。而其余60%左右的KRAS野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。

在美国胃肠病学会（AGA）2008年1月份举行的会议上，有研究评估发现，进行常规KRAS基因检测，可为美国医疗保障体系节省6.04亿美元。KRAS突变突变检测已知和未知位点点突变多重突变插入/缺失SNP分析二，三和四等位基因SNPs多重SNPs

等位基因定量

SNP发生率二，三和四等位基因突变基因检测

PyroMark–多种基因分析的技术平台基因检测

KRAS突变状况的重要性抑制细胞增殖和生存EGFR成为癌症治疗的一个重要靶体:抗-EGFR抗体用于结直肠癌治疗(CRC):Erbitux®

(Imclone),Vectibix®

(Amgen)成功的抗EGFR治疗阻止细胞增殖和生存

EGFRKRAS细胞生长因子细胞膜单克隆抗体

Cetuximab

(Erbitux)西妥昔单抗Panitumumab(Vectibix)帕尼单抗YEGFRKRAS生长因子

细胞膜单克隆抗体Cetuximab(Erbitux)西妥昔单抗Panitumumab(Vectibix)帕尼单抗Y抑制细胞增殖和生存KRAS基因突变致使细胞内KRAS蛋白持续活跃从而导致对抗-EGFR抗体产生耐药KRAS基因突变是复杂且多位置的突变最常见的KRAS活动性突变发生在12,13和61密码子肿瘤细胞KRAS基因的状况可以作为预后的指针和预测特定药物的临床应答基因检测

KRAS突变状况的重要性抑制细胞增殖和生存EGFR成为癌症治疗的一个重要靶体:抗-EGFR抗体用于结直肠癌治疗(CRC):Erbitux®

(Imclone),Vectibix®

(Amgen)成功的抗EGFR治疗阻止细胞增殖和生存

EGFRKRAS生长因子细胞膜单克隆抗体

Cetuximab

(Erbitux)西妥昔单抗Panitumumab(Vectibix)帕尼单抗YCodon61FPFPBSeqRPBRPSeqGGTGGCGTAGGTCCAGTTCTCCodon12&13ReverseassaydesignForwardassaydesign灵活的设计使我们可以在一个反应中方便的分析连续多个突变位点FPorFPB=forwardPCRprimerRPorRPB=reversePCRprimerB=biotinylatedSeq=sequencingprimerPyroMarkKRASAssayDesign密码子GGTGGCTGTAGCCGTCGCAGTTGCGTTGACGCTGTCGAT1213CAAAAAGAACGACCACTACACCAT61野生型

主要突变发生在KRAS基因的12,13和61密码子

野生型KRAS突变型KRAS密码子12密码子12突变:GGT>GATPyrosequencing（焦磷酸测序）技术提供序列信息和定量结果用于所有主要KRAS基因突变的敏感检测密码子GGTGGCTGTAGCCGTCGCAGTTGCGTTGACGCTGTCGAT1213CAAAAAGAACGACCACTACACCAT61野生型

Sequencetoanalyze:GGTGGCGTAGG主要突变发生在KRAS基因的12,13和61密码子

举例分析：密码子12上第2个碱基PyroMarkKRAS试剂

定量结果和序列信息A:44%C:0%G:56%T:0%A:1%G:99%EESSTTAACCGGAACCTTCCAAGGAATTGGCCGGTTAAGG0100200Codon12mutation:GGTGATA:0%C:0%G:100%T:0%A:40%G:60%EESSTTAACCGGAACCTTCCAAGGAATTGGCCGGTTAAGG0100200300Codon13mutation:GGCGACA:0%C:0%G:100%T:0%A:0%G:100%EESSTTAACCGGAACCTTCCAAGGAATTGGCCGGTTAAGG050100150wtK-RasPatientno.4Patientno.5Patientno.6Sequencetoanalyze:GGTGGCGTAGGDataprovidedbyDrMagnusSundstrom,UppsalaUniversityHospital,Sweden密码子12/13发生变异的病人结果13密码子1％突变（GGCGAC)Pyrosequencing（焦磷酸测序）

三种焦磷酸测序的应用

基因检测表观遗传学微生物表观遗传学

DNA甲基化DNA甲基化

CpG二核苷酸的胞嘧啶被添加了一个甲基基团过程可逆CpG岛富含CpG二核苷酸:每10个核苷就有1个CpGCpG岛主要位于基因的启动子区域CpG岛存在于的60％人类基因启动子中功能DNA甲基化可引起基因的失活人类70-80%的CpGs被甲基化大多数没有被甲基化的CpGs位于基因的调控区癌症相关高度甲基化和肿瘤抑制基因的失活低甲基化和至癌基因的激活(e.g.K-ras,C-myc)Pyrosequencing对于DNA甲基化的分析

对于CpG位点有始终如一的精确Pyrosequencing能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域Pos.1Pos.2Pos.3

Pos.4Pos.5

Pos.6

Pos.7

Pos.8Pos.9Pos.10MGMTgenePyrosequencing（焦磷酸测序）

三种焦磷酸测序的应用

基因检测表观遗传学微生物Pyrosequencing对于微生物的鉴定

应用微生物鉴定细菌/病毒/真菌鉴定微生物分型（乙肝分型、丙肝分型）

举例：广谱类:16S细菌,普通的真菌Panel-based:脑膜炎,念珠菌,革兰氏阳性菌,分支杆菌不同种属:e.g.幽门螺杆菌（H.Pylori）,副百日咳菌/百日咳杆菌（Bordetellaparapertussis/pertussis;）单核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）不同亚型:e.g.炭疽芽胞杆菌,结核分支杆菌,淋球菌耐药检测举例H3N2耐药突变监测H1N1耐药利福平耐药肠球菌的利奈唑酮耐药乙肝耐药突变（如YMDD突变)Pyrosequencing对于微生物鉴定

16S细菌16S基因内序列特异性区域正向PCR引物反向PCR引物测序引物举例：1个常用的靶基因－－

16S

基因所有引物都设计在保守区域测序引物设计在保守区，在可变区的上游Pyrosequencing对于微生物的鉴定

应用微生物鉴定细菌/病毒/真菌鉴定微生物分型

举例：广谱类:16S细菌,普通的真菌Panel-based