第八章mRNA剪接编辑

mRNA剪接编辑真核生物基因组DNA的结构真核基因大多是断裂的:一个基因可由多个内含子和外显子间隔排列而成。内含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超过99%。RNA部分人类基因中内含子序列所占的比重分析前体mRNA--hnRNA5’-Cap3‘-Poly(A)mRNA剪接成熟mRNA的转运RNA加工过程及其生理功能断裂基因hnRNA，hnRNP，sRNAExons(外显子):thecodingsequencesIntrons(内含子):theinterveningsequencesRNAsplicing:去除pre-mRNA的内含子形成成熟mRNA的过程.Spliceosome剪接体Self-splicingintronsandmechanismsAlternativesplicing(可变剪接):有些pre-mRNAs可以通过不同的剪接方式产生不同的成熟的mRNA.60%ofthehumangenesaresplicedinthismanner.hnRNAhnRNA(heterogeneousnuclearRNA):核内不均一RNA，是mRNA的原初转录产物在核内形成的大小不等的中间物，相对分子质量大，也不均一，成为hnRNA。hnRNA与mRNA的关系：两者具有部分相同的序列；两者都可以做翻译的模板；两者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴；两者都是由RNA聚合酶转录hnRNPhnRNP:核糖核蛋白颗粒hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒(hnRNP)，颗粒中蛋白质包围着hnRNA，这种hnRNA和蛋白质组成的复合物称为hnRNP。1.mRNA加帽帽子结构(m7GpppGp-)7-甲基鸟核苷三磷酸:它由甲基化鸟苷酸经焦磷酸化与mRNA的5‘末端核苷酸相连，形成5’,5‘-三磷酸连接(5’,5‘-triphosphatelinkage)，mRNA5’端的这种结构称为帽子(cap)。

反应空间：在mRNA的5‘-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内，即hnRNA即可进行加帽。加工过程:首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G进行甲基化。加帽的顺序 当新生RNA链长度约为25nt时，其5’端经修饰被加上一个7-甲基G，以5’-5’三磷酸连接。RNA三磷酸酶(Triphosphatase)鸟苷酸转移酶（guanyltransferase）鸟嘌呤-7-甲基转移酶（guanosineethyltransferase） 反应步骤如下：核苷酸水解酶从RNA的5‘-端切掉γ基团；鸟苷酸转移酶将来自GTP的GMP连接到RNA5’-端的β磷酸上，形成5-5三磷酸，释放出PPI甲基转移酶催化SAM的甲基转移到Cap-0的N7位。CAP1:OCH3CAP2:OCH3CAP0SAMStep2Step1

GMPStep3RNA三磷酸酶鸟苷转移酶帽子的类型在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O类帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-O位点上还有一个甲基位点的称1类帽子(cap1)；此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位点的称2类帽子（cap2）。这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontednucleotidestructure）。HN—CH3m7G帽子0mRNA5端的帽子位置

和可被甲基化的位点三种5’帽结构形式帽0m7GpppXpYp------普遍存在帽1m7GpppXmpYp-----普遍存在帽2m7GpppXmpYmp-----很少发生帽子结构的功能有助于mRNA跨越核膜转运;保护mRNA5′不被酶降解；使mRNA能与核糖体小亚基结合；被蛋白质合成的起始因子所识别，促进蛋白质合成;提高剪接效率2.PolyA尾巴多聚腺苷化的信号及参与的蛋白因子有效的信号是：AAUAAA及随后的23-24nt的富GU区，再后的富U区。参与的蛋白因子： CPSF，CstF，CFI，CFII加尾反应需要的顺式元件

3端添加多聚腺苷酸长度：20～200nt加尾信号：切割与加尾：

a.剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor,CPSF）

b.剪切刺激因子（cleavagestimulationfactor,CstF）

c.剪切因子I，II（CFI，CFII）

d.poly(A)多聚酶（polyadenylatepolymerase,PAP）

e.poly(A)结合蛋白（poly(A)bindingprotein,PBP）mRNA的多聚腺苷酸化过程CPSF因子专一性与加尾信号AAUAAA结合CstF因子与富GU区结合CFI、CFII在加尾信号下游的15～25nt处切割poly(A)多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加约10个腺苷酸，速度较慢poly(A)结合蛋白的结合加快多聚酶延伸速度，控制多聚腺嘌呤尾巴的长度CPSFPAPPAPBPolII的CTD促进切割3端多聚腺苷酸尾巴的功能提高mRNA的稳定性在核－质转运中起作用提高mRNA的翻译效率影响最后一个内含子的切除创造终止密码子UGA选择性加尾调节基因的表达3.RNA剪接(Splicing)真核生物mRNA前体的剪接mRNA前体的加工内容：

3.内含子的剪接

1.5端添加帽子结构2.3端添加多聚腺苷酸1.mRNA依赖snRNA的拼接2.选择拼接3.顺式和反式拼接4.I型自我拼接5.II型自我拼接真核生物成熟mRNA形成的过程 断裂基因发现不久，Crick（1978年）提出了一系列发人深思的问题：（1）剪切作用若是通过酶来进行的，那么这种剪接酶是怎样识别RNA上特定的位点？（2）剪切酶有没有特异性？对不同的RNA是否需要不同的酶？（3）切除的RNA是以线状还是环状存在的？切下的RNA的命运将如何？Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点，发现有2个特点：（1）内含子的两个末端并不存在同源或互补；（2）连接点具有很短的保守序列,亦称边界序列。100种内含子的5′端都是GU；3′端都是AG，因此称为GU-AG法则（GU-AGrule），又称为Chambon法则。GU-AG法则5’splicesite(5’剪接位点):

theexon-intronboundaryatthe5’endoftheintron3’splicesite(3’剪接位点):

theexon-intronboundaryatthe3’endoftheintronBranchpointsite(分枝位点):anAclosetothe3’endoftheintron,whichisfollowedbyapolypyrimidinetract(Pytract).两个剪接位点的序列是不同的，左边的剪接位点称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。GU-AG法则（GU-AGrule）不适用于线粒体、叶绿体的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因mRNA结构特点边界序列:其边界序列是完全符合GU-AG法则分枝点序列：具有分枝点序列，位于内含子3’端上游18-50nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95，其中A为百分之百的保守，且具有2’-OH。内含子5′端有一保守序列(5’-GUAAGUA-3’)可以和U1snRNA的5’端的保守序列3’-CAUUUCAU-5’互补。mRNA的剪接转录产生的核内RNA前体分子与蛋白质结合，形成RNA和蛋白质组成的snRNP复合物（ribonucleo-proteinparticle）。随着RNA链的延伸，每个内含子5’和3’两端的复合物成对联结，产生60S的颗粒—剪接体（spliceosome），进行RNA前体分子的剪接。细胞核中的小分子RNA称为细胞核小RNA（smallnuclearRNA,snRNA);位于细胞质中的称为细胞质小RNA(smallcytoplasmicRNA,scRNA)。在自然状态下，它们以核糖核蛋白颗粒（SnRNP和scRNP）的形式存在，俗称snurps和scyrps。在核仁中也存在着一类小的RNA，称为核仁小RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA),它们在rRNA的加工中起作用。snRNA参与剪接过程，并于其它蛋白一起构成一个大的颗粒复合体,称为剪接体(splicesome)。Spliceosome(剪接体)剪接过程由U1,U2,U4,U5,U6snRNPs催化，也有其他剪接因子的参与。这些snRNPs中的RNA成分与5’-和3’剪接点及分支点的多种保守碱基配对。Splicesome:ThelargeRNA-proteinbodyonwhichsplicingofnuclearmRNAprecursorsoccurs.剪接体中的snRNP的功能snRNPsnRNA(nt)在拼接中可能的作用U1165通过序列互补，结合到5拼接位点上U2185结合到分枝位点(U2AF)，催化转酯反应,与U6配对U5/U4/U6116/145/106三聚体U5:结合5与3拼接点外显子U4：拼接体的组装U6：结合5拼接点，与U2一起催化转酯反应

U2和U6构成催化反应的核心,U5拉近相邻的2个外显子U2snRNP可以与分支点序列配对U6snRNP可以与5‘端剪接区域配对真核生物mRNA前体中内含子剪接过程示意图由U1snRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5’剪接点，由结合在3’剪接点上游富嘧啶区的U2AF（U2auxiliaryfactor）识别3’剪接点并引导U2snRNP与分支点相结合，形成剪接前体（pre-spliceosome）。剪接前体进一步与U4、U5、U6snRNP三聚体相结合，形成剪接体。拼接体组装第一次转酯：左外元、内元剪切套索第二次转酯：exons连接、套索状内元释放拼接体(spliceosome)解体与套索(lariat)降解同步ThesimplifiedmechanismofnuclearmRNAprecursor5’-splicingsite2‘-hydroxylgroupofAresidueofbranchpoint3’-splicingsiteLariart

Debranch°radedBiochemicalstepsofpre-mRNAsplicingacutismadeatthe5’splicesite,separatingtheleftexonandtherightintron-exon.Therightintron-exonmoleculeformsalariat(套马索),inwhichthe5’-terminusoftheintronbecomeslinkedbya5’-2’bondtoabasewithintheintron.ThetargetbaseisanAinasequencethatiscalledthebranchsite.Step1ofSplicingStep1ofSplicingStep2:

cuttingatthe3’splicesitereleasesthefreeintroninlariatform,whiletherightexonisligated(spliced)totheleftexon.U6与U2配对,催化转酯反应U5拉近相邻外显子第2次转酯反应哺乳动物细胞中mRNA前体上的snRNP是从5’向下游“扫描”，选择在分支点富嘧啶区3’下游的第一个AG作为剪接的3’受点。AG前一位核苷酸可以影响剪接效率，一般说来，CAG=UAG>AAG>GAG。如果mRNA前体上同时存在几个AG，可能发生剪接竞争。4.可变剪接

ALTERNATIVESPLICING背景在高等真核生物个体发育或细胞分化过程中可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行可变剪接，产生出组织或发育阶段特异性mRNA。脊椎动物中大约有5%的基因能以这种方式进行剪接，保证各同源蛋白质之间既具有大致相同的结构或功能域，又具有特定的性质差异，进而拓展了基因所携带的遗传信息。DrosophilaDSCAMgenecanbesplicedin38,000alternativeways12×48×33×2=38016ByusingdifferentpromotersByusingdifferentpoly(A)sitesByretainingcertainintronsByretainingorremovingcertainexons小鼠免疫球蛋白重链基因的选择性剪接可变剪接关于内含子的不同形式Anexampleofconstitutivealternativesplicing:

SplicingoftheSV40TantigenRNA可变剪接使内含子中的终止信号进入mRNA，翻译提前终止可变剪接可以是组成型表达也可以是诱导型表达Constitutivealternativesplicing:morethanoneproductisalwaysmadefromapre-mRNA.

组成型可变剪接：前体mRNA通过可变剪接总能生成多种不同的mRNA。Regulativealternativesplicing:differentformsofmRNAareproducedatdifferenttime,underdifferentconditions,orindifferentcellortissuetypes.

诱导型可变剪接：前体mRNA在不同的发育阶段、不同的生理调节、在不同的细胞或者组织中经过可变剪接产生不同的成熟mRNA。Theoutcomeofalternativesplicing(可变剪接的结果/生物学功能)Producingmultipleproteinproducts,calledisoforms.Theycanhavesimilar,distinctorantagonisticfunctions.Onegeneencodesmultiplefunctions.

2. Switchingonandofftheexpressionofagivengenethatencodesonlyonefunction.Whentheexoncontainingastopisincludedtoproducenonfunctionalprotein,ortheintronisincludedtopreventmRNAtransport.顺式和反式拼接

(cis-/trans-splicing)反式拼接：两个或更多不同的基因的初始转录本上的外显子被连接在一起。Cis-splicingtrans-splicing反式剪接（trans-splicing）

●以一条pre-RNA为底物以两条不同来源的pre-RNA为底物

●在spliceosome中完成在spliceosome中完成

●组成型剪接在成熟RNA的5’端选择性剪接拼接一外来的35Nt的splicedlead

(对供点或受点的识别差异)(SL,剪接前导序列)cis-splicing

tans-splicing

3.Self-splicingintrons自剪接内含子Self-splicingintronsrevealthatRNAcancatalyzesplicing自剪接内含子：

---前体RNA中的内含子折叠形成特异性的构型，能够催化自身内含子的释放和外显子的链接。---Theycanremovethemselvesfrompre-RNAsintheabsenceofanyproteinsorotherRNAsinvitro.自剪接内含子的类型两类自剪接内含子groupIself-splicingintronsgroupIIself-splicingintrons.I类内含子常分布于低等真核生物的细胞器中四膜虫，绒泡菌（Physarumpolycephalum）的rRNA；•大部分真菌如酶母的mtDNA；•植物叶绿体基因的内含子；•酵母细胞色素B基因（ScCOB）；•原核生物-T4噬菌体的3个基因中也存在1类内含子。I类内含子的结构特点其边界序列为5′U-G3′；自我剪切和自我环化，具有中部核心结构(Centralcorestrucature)和内部引导顺序(internalguideseguenceIGS)，在没有蛋白辅因子存在的前体下RNA能直接催化体外自身的接合作用----核酶二价金属离子对于折叠和催化作用来说是必需的，(Ca2+,Mg2+,Mn2+对折叠有帮助;Mg2+,Mn2+对催化有帮助)自环化需要鸟嘌呤核苷作为辅因子I类内含子的自我剪接过程自由鸟苷酸的3’-OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链。上游外显子的自由3’-OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键相连Ⅱ类内含子和I类内含子剪接不同；和核mRNA内含子的剪切有些相似，但也有不同之处边界序列为5′↓GUGCG……YnAG↓，符合GU-AG法则。二级结构的形成使两个并列的功能区靠近。分支点序列（branch-pointsequence）在内含子的3'，可和上游序列互补，形成茎环，但A不配对。Ⅱ类内含子分布在：酵母mtRNA，细胞色素氧化酶的α亚基，β亚基，玉米mtRNA，tRNA真核mRNA前体中

d3d2

d4

d1

d5

d6A

GOH

活性中心

外显子1外显子2

Ⅱ类内含子的二级结构分枝点腺苷酸的2’-OH作为亲核基团攻击内含子5’端的磷酸二酯键，内含子5′的边界序列上的G以5′磷酸和分枝点A的2′-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构上游外显子的3’-OH作为亲核基团攻击内含子3’位核苷酸上的磷酸二酯键，使套索结构完全解离。上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键相连II类内含子的自我剪接过程三种类型的RNA剪接比较类型丰度机制催化方式套索结构pre-mRNAVerycommon;mosteukaryoticgenesTwosequentialtransesterificationreactions;branchsiteAspliceosome+GroupIIintronsRare;someeukaryoticgenesfromorganellesandprokaryotesSameaspre-mRNARNAenzymeencodedbyintron(ribozyme)