第八章 酶的固定化

不稳定：在高温、高压、强酸、强碱下易失活，即使在最适条件下反应；2.回收困难，不能重复使用：经济上不合算；3.反应速度减慢，不容易与毒副分子和产物分离。

游离酶的不足：什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固相酶、固定化酶）固定化技术

固定化酶：固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。酶的固定化固定化酶的优点增加酶稳定性，可反复或连续使用，提高使用效率，降低成本易于和反应产物分开，产物溶液无酶残留，简化提纯工艺酶反应过程可严格控制较游离酶更适合多酶反应增加产物收率，提高产物质量5.1.1酶的固定化方法微囊型固定化方法吸附法结合法交联法包埋法网格型共价键结合法离子键结合法B.半透膜包埋法(微囊）：

将酶或细胞包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶或固定化细胞。(适用于产物、底物分子量小的）①常用载体———半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜②制备方法：将酶液滴分散在与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜，将酶包埋在微胶囊之中。

四、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联的形式：（1）酶直接交联法（2）酶与辅助蛋白交联法各种固定化方法的优缺点比较各种酶固定化方法的比较5.1.3固定化酶的特性

（1）酶的活性：通常低于天然酶（有例外）。

（2）酶的稳定性

酶的热稳定性、储存稳定性、操作稳定性以及对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。

可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。

（3）酶的最适温度

最适温度变化不大。有些酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。（4）酶的最适pHa.载体性质的影响b.产物性质对最适pH值的影响带负电荷载体：产物为酸性：最适pH值高一些；

最适pH向碱性偏移。产物为碱性：最适pH值低一些；带正电荷载体：

产物为中性：最适pH值一般不改。最适pH向酸性偏移。

（5）米氏常数

米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。使固定化酶Km变动的原因，主要是由于载体与底物间静电相互作用。

固定化载体与底物电荷相反，固定化酶的表观Km值降低。固定化载体与底物电荷相同，固定化酶的表观Km值显著增加。

（6）底物特异性

作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。1.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次的使用；2.易与底物、产物分开有利于控制生产过程；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；3.在绝大多数情况下提高了酶的稳定性；4.较能适应于多酶反应；5.

提供了研究酶动力学的良好模型。固定化酶的优点（与游离酶比较）：固定化酶的缺点：（1）酶固定化时酶的活力有所损失。（2）增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。（3）比较适应水溶性底物和小分子底物。（4）与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。

5.2细胞固定化

固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。固定化细胞的分类原因之一:细胞壁对物质扩散的障碍原生质体微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后就可获得(1)保护了原生质体(2)利于氧的传递、营养成分的吸收和胞内产物的分泌一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。

5.3原生质体固定化（二）固定化原生质体的特点有利于胞内物质的分泌稳定性好有利于产物的分离纯化需添加渗透压稳定剂1．固定化酶在工业生产中的应用现已用于工业生产的固定化酶主要有：氨基酰化酶葡萄糖异构酶天门冬氨酸酶青霉素酰化酶延胡索酸酶β－半乳糖苷酶天门冬氨酸-β-脱羧酶脂肪酶植酸酶

5.5固定化酶的应用18/1382.固定化酶在酶传感器方面的应用酶传感器是由固定化酶与能量转换器（电极、场效应管、离子选择场效应管等）密切结合而成的传感装置，是生物传感器的一种。广泛用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。生物传感器原理图本